上海師範大學
實驗報告
專業、年級生物科學班級姓名學號
課程名稱免疫學實驗名稱多轉殖抗體的製備（可溶性抗原） 實驗日期
基本原理
免疫動物是通過給待免疫的動物注射抗原，使其獲得相應的抗體的過程。抗原給予的方法不僅對免疫應答的起始有較大影響，而且決定著對新注射抗原的免疫吞噬和吞噬後加工處理的細胞型別，並影響對其發生免疫應答的外周淋巴器官。
材料(一) 動物：健康雄性家兔2只
(二) 器材：剪刀、鑷子、注射器(2ml、50ml)附針頭(9號、6號)、稱量瓶(10ml)、量筒、動物固定架、滅菌三角燒瓶(200ml)、手術器械一套、血管夾、黑絲線、塑料放血管等。
(三) 試劑
1. 滅菌生理鹽水；
2. 純化人igg(10mg／ml)；
3. 消毒酒精及碘酒；
4. 弗氏不完全佐劑（fca）
5. 弗氏完全佐劑（fia）
6.弗氏完全佐劑乳化抗原(fca-igg)的製備：吸2ml fca於研缽中，逐滴加入1mg／ml純化人igg 1 ml，邊滴入邊研磨直至形成均一性的乳狀液，取1滴滴於冷水面上不散開為合格。
7. 弗氏不完全佐劑乳化抗原(fia-igg)的製備：吸2ml fia於研缽中，逐滴加入1mg／ml純化人igg 1 ml，邊滴入邊研磨直至形成均一性的乳狀液，取1滴滴於冷水面上不散開為合格。
免疫方法
1. 用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒**；
2. 第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐劑(fca)乳化的抗原(人igg)下稱fca-igg)液1ml，每側腳掌皮下各注入0.5ml。
3. 第二次免疫：間隔14天後，於兩側膕窩及鼠蹊部腫大的淋巴結內注入fia-igg，每個淋巴結注0.
1ml，其餘注入淋巴結附近皮下共1ml。如淋巴結未腫大或腫大不明顯時，直接注入兩側膕窩及鼠蹊部皮下。
4. 間隔10天後，從耳靜脈採血0.5～1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價(即試血)。效價至少應達到1∶16以上時才能放血。
5. 若效價未達到要求，可用不加佐劑的抗原液(人igg)耳靜脈內注射免疫。即於1週內注射3次，分別為0.
1、0.3、0.5ml。
間隔1週再試血。如效價達到要求應立即放血。另外,也可在第2次免疫後，以弗氏不完全佐劑(fia)乳化的抗原(人igg)(簡稱fia-igg)再免疫1-2次。
注射部位、劑量和間隔均同第2次，再試血測抗體效價，如效價達到要求立即放血。
首次注射後一周或稍長時間再次進行加強注射，可大大增強免疫應答。
對免疫原性弱的抗原，需要多次注射 (注射5-6次)，可以在適當的時間間隔內，有效的控制抗體效價的增加。
放血頸動脈放血
將兔仰臥，固定於兔臺，剪去頸部的毛，切開**，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴格按無菌要求進行。
分離血清
將三角***血置37℃溫箱1小時，再置4℃冰箱內3～4小時。待血液凝固血塊收縮後，用毛細滴管吸取血清。於3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑(0.
01％硫柳汞或0.02％疊氮鈉，最終濃度)，分裝後置4℃冰箱中儲存備用。
結果鑑定
效價的測定——雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產生沉澱線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。
瓊脂板的製備：100ml ph7.1 的磷酸鹽緩衝液加到1.
5g的瓊脂內，於水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（nan3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在乾淨平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固後，用打孔器打孔。
**孔內加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內分別加入50μl 1：2、1：4、1：
8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉澱線產生以判斷血清的稀釋度。
注意事項
1. 免疫用實驗動物的抗體反應性個體差異性較大，因此免疫時至少應選用兩隻以上動物。另外，不能使用妊娠動物。
2. 免疫用的抗原必須經fca或fia充分乳化後才能注射，否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述製備乳化抗原的方法較費時、費力。
採用h-81微型振盪混合器法或三腔管研磨法製備。前者是將抗原液與佐劑按比例混合後，置於混合器上使之劇烈振盪(頻率2900轉／分，振幅6mm)；後者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合後，吸入注射器內再將注射器連線於三腔管上反覆抽吸研磨。這兩種方法約1小時即可使抗原充分乳化。
3. 佐劑一方面可提高特異性免疫反應的效果獲得高效價的免疫血清，但若抗原不純時，可使抗原中極微量的汙染物(0.005mgn)產生抗體，以致導致免疫血清的純度受到影響。
另外，有些實驗動物種系對bcg過敏，尤其是豚鼠，當再次注射完全佐劑時,可以引起**反應而導致免疫失敗。為此，第二次免疫注射時應減少佐劑中bcg的含量或改用不完全佐劑，以減少和防止**反應的發生。
4. 抗原的劑量決定於抗原的種類。對免疫原性強的抗原劑量應相別較少，免疫原性弱的抗原劑量可相對較多。
抗原的用量一般以體重計算。在使用佐劑的情況下，一次注入的總劑量以0.5mg／kg體重為宜。
如不加佐劑時劑量可加大10倍。另外，免疫週期長者可少量多次注射，免疫周期短者可較大量少次注射。
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