２０１１年ｌ第６卷第１２期２月中國科技****
ｄｅｃ２０ｌ１
裂殖酵母ｈｓｐ９０多轉殖抗體的製備與鑑定
李文珠 ，李曉彤２，張連茹 ，靳全文
（１．廈門大學生命科學學院，福建廈門廈門大學生命蝌學學院雜交瘤與才亢體中心，福建廈門，３６１００５）
摘要：為製備兔抗裂殖酵母ｈｓｐ９０多轉殖抗體，在通過ｐｃｒ獲得了裂殖酵基因後，構建
ｓｗｏ１表達載體，可用於表達編碼正確氨基酸序列的目的基因。轉化大腸桿菌誘導表達柱純化。目的蛋白表達量佔菌體總蛋白的３０％以上。
純化後，蛋白純度達９５％以上。純化後的ｍｂｐ．ｓｗｏ］融合蛋白抗原加福氏完全佐劑背部皮內注射首次免疫紐西蘭大白兔，第２８天用ｍｂｐ．ｓｗｏｌ融合抗原加福氏不完全佐劑同樣劑量
加強免疫，第３５天時再次免疫。第４９天心臟採血。收集血清後，用免疫印跡檢：
￣）ｓｗｏｌ多轉殖抗體的特異性。免疫印跡檢測結果顯示該抗體能夠特異性識別內源性的裂殖酵母蛋白，但並不識別人類細胞中的
關鍵詞：裂殖酵母多轉殖抗體中圖分類號：ｑ２９１
文獻標誌碼：ａ
文章編號
收稿日期
**專案：高等學校博士學科點專項科研**資助專案國家自然科學**資助項教育部科學
技術研究重點項
作者簡介：李文珠（１９８３一），女，博士研究生，主要研究方向：細胞生物學
通訊聯絡人：靳全文，教授，主要研究方向：細胞週期調控及表觀遺傳學
９１２中國科技****第６卷第ｌ２期
２０１１年１２月
熱激蛋白又名應激蛋白ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ。將上清轉移人新的離心管中，加入
是細胞在高溫、缺氧和重金屬中毒等應激狀態下產生的一類具有重要生理功能、高度保守的多肽類蛋白質分子家族。生理狀態時，熱激蛋白可協
助多肽或蛋白質的正確轉運、摺疊與裝配，起「分子伴侶」的作用 。根據其相對分子質量的大小分為６個家族和小分子
ｈｓｐ。
９００無水乙醇（一２０℃預冷），混勻，室溫放置離心５ｍｉｎ，棄上清。２００體積分數７５％乙醇（一２０℃預冷）沖洗１次離心１ｍｉｎ，
棄上清。室溫乾燥，加入５０ｔｅ和１ｒｎａｓｅａ溶解沉澱。凝膠電泳檢測提取的基因組ｄｎａ。１．３引物設計
從資料庫上查得酵母ｓｗｏｌ基因的全序列，設計ｐｃｒ引￣３＃１３９：
ｈｓｐ９０是細胞內最活躍的分子伴侶之一，廣泛參與細胞的訊號轉導、激素應答及轉錄調控過程，對細胞生理、病理及應激條件下的生存發揮了重要作用ｈ。ｈｓｐ９０是相對分子質量為９０ ０００的疏水陛蛋白質，其在生物
進化過程中高度保守，在多種生物體細胞中呈高組成性
表達，通常以同二聚體形式存在，約佔胞質蛋白的
１￣／ｏ￣２％。在高等真核生物體內，ｈｓｐ９０由ｈｓｐ９０ａ和ｈｓｐ９０￣單體聚合而成，兩種單體的區別在於是否含有豐富的谷氨醯胺片段ｐｊ。ｈｓｐ９０的作用底物與多種訊號轉導通路密切相關副，近年來引起了人們更多的關注。
在裂殖酵母中ｈｓｐ９０蛋白由ｓｗｏｌ基因編碼。
本研究在成功構建裂殖酵母表達載體、細菌誘導表達裂殖酵母ｈｓｐ９０後，進一步製備了抗ｓｗｏｌ多轉殖抗體，並鑑定了其特異性。
１實驗１．１材料
限制性內切酶以及工具酶和購自ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司。
購自天根公司。質粒提取及膠**試
劑盒購自上海生工****。引物由英濰捷基**有限
公司合成。ａｎｔｉ．ｇｆｐ多轉殖抗體由本實驗室製備。鼠抗購自公司。所使用的裂殖酵
母菌株均為本實驗室儲存菌株一３２ ｕｒａ４一
和一一１－２酵母基因組ｄｎａ的製備
接種一定量的酵母細胞到１０ｍｌⅶ５ｓ液體培養基
中，３０℃培養過夜離心５ｍｉｎ，收集菌體。加入５００山梨醇溶液重懸，再加入２０２５ｍｇ／ｍｌ酵母裂解酶、１，ｐ一巰基乙醇及４９二次蒸餾水，混勻，３７℃處理２～３ｈ。顯微鏡下觀察到大部分細胞變圓時離心５ｍｉｎ收菌，加入５００三羥甲基氨基甲烷一乙二胺四乙酸緩衝液ｉｊ￣，ｔ２，重懸。
加入５０１０％十二烷基硫酸鈉，混勻，６５℃放置３０ ｍｉｎ。加入
醋酸鉀混勻，冰上放置
ｃｇｃ巡
和＃１４０：
ａｔｃ，由上海英濰捷基****合成，下劃線處分別為
ｂａｍｈｉ和風ｆｉ酶切位點基因的ｐｃｒ擴增
以提取的酵母基因組為模板，利用引物＃１３９和＃１４０，常規ｐｃｒ擴增酵母ｓｗｏｌ 基因。反應條件為：９５℃預變性４ｍｉｎ—９５℃變性５０ｓ，５５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ；迴圈數３０—７２℃延伸１０ｍｉｎ一４℃儲存。
表達質粒的構建
ｐｃｒ產物及ｐｍａｌｃ２ｘ載體分別用限制性內切酶ｂａｍｈ ｉ和風ｆｉ進行雙酶切，並且分別膠**。用ｔ４
ｄｎａ連線酶將ｓｗｏｌ基因轉殖至載體ｐｍａｌｃ２ｘ中，構建表達質粒並轉化入提取重組子質粒進行酶切鑑定，陽性轉殖送上海英濰捷基公司測序。
１．６細菌中融合蛋白的表達和純化
挑選轉化了測序正確的重組質粒
的單菌落，３７℃振盪培養過夜，按
１：１００（體積比）稀釋到ｌｂ培養液中，３７℃振盪培養
至 ６０００．６時，加入終濃度為０．５ｍｍｏｌ／ｌ的異丙基移ｄ＿
硫代吡喃半乳糖苷誘導表達５ｈ。將收集的１００ｍｌ菌體完全重懸於１０ ｍｌ細菌裂解液（ｐｎ ８．０，三羥甲基氨
基甲烷一鹽酸５０ｍｍｏｌ／ｌ，氯化鈉１ｍｏｌ／ｌ，乙二胺四乙
酸５ｍｍｏｌ／ｌ，體積分數１０％的甘油）裡，在冰上超聲
破碎５ｍｉｎ至菌液澄清；破碎產物於離心１０ｍｉｎ。將上清液加至層析柱中，
４℃孵育２ｈ。然後加入４０ｍｌ緩衝溶液（ｐｈ８．０，三羥
甲基氨基甲烷－鹽酸５０ｍｍｏｌ／ｌ，氯化鈉乙
二胺四乙酸甘油，巰基乙醇５ｍｍｏｌ／ｌ）洗柱，用含２０ｍｍｏｌ／ｌ麥芽糖的緩衝溶液（ｐｈ８．０，三羥甲基氨基甲烷一鹽酸５０ｍｍｏｌ／ｌ，氯化鈉
乙二胺四乙酸甘油）洗脫融合蛋白，收集洗脫液。
第２０１１年１２月裂殖酵母ｈ
農坦阡 「 ｐ 夕見性仉口 ｕ笛司盒止ｓｐ９０多轉殖抗體的製備與鑑定
９１３１．７抗體的製備
按照文獻［９衝的步驟製備抗體。
１．８免疫印跡檢
根據蛋白大小配置一定濃度的膠，待其凝固後，加入樣品及其對照。接通電源，按照濃縮膠電壓１００ｖ，
０００分離膠電壓１２０ｖ，進行ｓｄｓ—ｐａｇｅ分析。然後用濕
法轉膜儀１００ｖ恆壓轉膜１－３ｈ，可根據蛋白的大小調節轉膜時間；之後用含５％ｂｓａ的ｔｂｓ溶液室溫封閉
２ｈ，接著用一抗工作液（ｔｂｓ＋一抗）４℃搖床過夜，ｔｂｓ．ｔ沖洗４次，每次５ｍｉｎ；二抗工作液（ｔｂｓ＋二
口 ｈｉ和ａｆｉ酶切的
抗）室溫孵育１ｈ，ｔｂｓ．ｔ沖洗４次，每次１０ｍｉｎ；在暗室條件下用ｅｃｌ工作液孵育ｐｖｄｆ膜暗室顯影，定影，觀察實驗結果。
２結果與討論
２．１ｓｗｏｌ 基因的ｐｃｒ擴增結果
設計的引物理論上經ｐｃｒ擴增後所得的基因全長應為２ ｌ４４ ｂｐ。以提取的酵母基因組ｄｎａ為模板，利用引通過常規ｐｃｒ擴增ｓｗｏｌ全長基因。圖１的１、２泳道中，可見２０００ｂｐ左右的產物帶，與理論計算的大小一致。
●２．２原核表達質粒的構建
用ｂａｍｈｉ和風ｆ１分別對載體ｐｍａｌｃ２ｘ和目的基因的擴增產物進行雙酶切。目的基因酶切產物經純化回
收後，在ｔ４ ｄｎａ連線酶的催化下，將其轉殖至質粒
ｐｍａｌｃ２ｘ中，構建表達質粒提取的
重組子質粒經ｂａｍｈｉ和 ｆｉ酶切後，瓊脂糖凝膠電泳鑑定，得到約２０００ｂｐ和６６００ｂｐ的條帶（圖２），與和的大小相符。
圖２重組質粒的雙酶切鑑定
將候選的轉殖子送往上海英濰捷基公司進行測序。用ｄｎａｓｓｉｓｔ軟體將測序結果翻譯後和ｓｗｏｌ蛋白序列進行比較分析。如圖３所示，用引物作為測序引物為測序結果（全長７０８ａａ），其中１＿４ａａ為ｂａｍｈ ｉ酶切位點，５－７０８ａａ為ｓｗｏｌ
氨基酸序列。結果說明轉殖至ｐｍａｌｃ２ｘ載體上的ｓｗｏｌ基因序列正確，起始密碼子、翻譯框架與預先設計一致。
圖３ｓｗｏ１的序列分析與比對結果
融合蛋白的表達
按１．６節方法所示，將重組表達質粒ｐｍａｌｃ２ｘ—
ｓｗｏ１轉人大腸桿菌ｂｌ２１後，經ｉｐｔｇ誘導，將收集的
菌體超聲破碎後的上清和沉澱懸液分別進行ｓｄｓ．
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２０１１年ｌ２月
ｐａｇｅ檢測。結果顯示，目的蛋白主要存在於上清中，表達量佔菌體總蛋白的３０％以上。圖４中可以在接近１２０ ０００位置可見ｓｗｏ１的表達蛋白，與理論推算值一
為了進一步驗證獲得的兔ａｎｔｉ．ｓｗｏｌ多轉殖抗體
的特異性，使用這一抗體嘗試檢測人類細胞中的ｈｓｐ９０
（圖結果表明，裂殖酵母ａｎｔｉ—ｓｗｏｌ多轉殖抗體不能識別人類腫瘤細胞ｓｇｃ７９０１（胃腺
致，掃瞄分析顯示其純度達９５％以上。純化後融合蛋白
約３ｍｇ，按照１．７節方法進行抗體的製備。
癌）、ｈｔ２９（大腸癌）、ｓｗ４８０（結腸癌肝癌）中的ｈｓｐ９０，而可以特異
地檢測到這些腫瘤細胞中的這就進一步表明所製備的裂殖酵母ａｎｔｉ．ｓｗｏｌ多轉殖抗體具有很高
的物種特異性。
ｌｌ一未經ｉｐｔｇ誘導；２—＿ｉｐ１ｂ誘導後總蛋白；３— １１ｇ誘導後可溶性蛋白；４＿＿ｉｐ１＇ｇ誘導後非漆｝生
蛋白圖４重組子超聲波破碎後上清產物的ｓｄｓ—ｐａｇｅ分析
２．４兔抗裂殖酵母ｓｗｏｌ多轉殖抗體的鑑定
分別製備野生型（ｊｙ≠｝１）和帶有ｇｆｐ標記的的裂殖酵母菌株總蛋白細胞裂解液，採用檢測免疫兔子後獲得的ｓｗｏ１多轉殖抗體的特異性。結果發現，實驗室製備的ａｎｔｉ．ｇｆｐ多轉殖抗體能夠特異性識別ｇｆｐ標記的ｓｗｏｌ蛋白。與此相對應多轉殖抗體也能夠特異性識別ｇｆｐ標記的
ｓｗｏ１以及野生型菌株中內源性的ｓｗｏｌ蛋白（圖５）。１２富
ｔｕｂｕｌｉｎ
ｌ一野生型（ｊｙ １）裂殖酵母茵株總蛋白細胞裂解液；２一帶有ｇｆｐ標記的的裂殖酵母菌株總蛋白
細胞裂解液
圖５蛋白質印跡分析兔抗裂殖酵母ｓｗｏ１多轉殖抗體的
特異性６一ａｃｔｉｎ
ａｎｔｉ—ｓｗｏｌ
１一ｓｇｃ７９０１（胃腺癌）；２一ｈｔ２９（大腸癌）；３一ｓｗ４８０（結腸
癌肝癌）
圖６蛋白質印跡分析免抗裂殖酵母ｓｗｏ１多轉殖抗體對
於人腫瘤細胞中ｈｓｐ９０的識別
２．５討論
在細胞內ｈｓｐ９０具有廣泛的生物學功能＿ｊ…。近年
發現ｈｓｐ９０與腫瘤的發生、發展關係比較密切。ｈｓｐ９０ｃ￣可通過調節細胞週期促進細胞增殖，ｈｓｐ９０１３
則能夠抑制細胞分 「ｊ。在裂殖酵母中，最初發現當
突變後，能夠抑制由ｗｅｅｌ激酶過量表達所帶來的ｇ２期阻斷現象發現ｓｗｏｌ會
影響肌球蛋白的功能，以及胞質**時肌動蛋白環的
裝配。研究還表明ｓｗｏｌ還很有可能參與葡萄￣／ｃａｍｐ訊號通路的調控 。
為了進一步了解ｓｗｏ１蛋白在裂殖酵母中的功能及
其機制，筆者成功地用ｐｃｒ方法擴增出全長ｓｗｏｌ基因片段，並連線至ｐｍａｌｃ２ｘ表達載體上，構建出重組質粒。ｐｍａｌｃ２ｘ表達載體帶有能改善溶解度的ｍｂｐ融合蛋白，避免ｓｗｏｌ蛋白形成聚集物，可增加蛋白的可溶性。獲得的融合蛋白能利用其中的ｍｂｐ對麥芽糖的親和性達到用柱一步親和純化，並且採
用麥芽糖溫和洗脫的蛋白無去汙劑或變性劑對蛋白活性的影響。
第６卷第１２期
２０１１年ｌ２月裂殖酵母ｈｓｐ９０多轉殖抗體的製備與鑑定９１５
３結論筆者直接使用ｍｂｐ—ｓｗｏ１融合蛋白免疫紐西蘭白
兔，採用心臟採血法收集抗血清，每只兔採血約３０ｍｌ。免疫印跡檢測結果顯示抗體能夠特異性地檢測裂殖酵
母ｓｗｏ１，而不能識別人類腫瘤細胞ｓｇｃ７９０１（胃腺癌）、ｈｔ２９（大腸癌）、ｓｗ４８０（結腸癌肝癌）
中的ｈｓｐ９０，說明製備的兔多轉殖抗體具有物種特異陛多轉殖抗體的成功製備，為進一步研究ｈｓｐ９０在裂殖酵母中的功能和機制提供了有力工具。
致謝：感謝廈門大學醫學院抗癌研究中心顏江華教授噱慨提供人類腫瘤細胞和ｂｅｌ７４０２。感謝廈門大學生命科學學院蕭淑燕同學對人
類培養細胞中實驗的幫助。
［參考文獻
【１】ｓｔａｎｇｌ
田．ｅｘｐ
叨ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ叨
１１—１５．田陰
［９］方莉，陳雪梅，任秀花，等．增強型綠色螢光蛋白兔多轉殖抗體
的製備 ．鄭州大學學報：醫學版
．［１ｏ】李娟，楊惠，周元國．熱激蛋白９０與熱激應答ｍ．生命的化學，
啊９０８—９１５．叨
自製活酵母的方法
1.蘋果半顆 2.水淹過蘋果即可 水不要太滿,要留空間給發酵時的空氣 3.高筋麵粉適量 4.蜂蜜少許 做法1.將蘋果半顆切成適當大小,放進有消毒過的容器中,加入水份,蓋上蓋子,放至溫暖的地方發酵,注意 每天都要開瓶子開啟透氣,搖晃瓶子讓空氣進去唷 2.第二天,開始出現泡泡 3.到了第三天,泡泡變多,...
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一.實驗原理 酵母核酸中rna含量較多，dna則少於 rna可溶於鹼性溶液，當鹼被中和後，可加乙醇使其沉澱，由此即可得到 製品。二.試劑 1.幹酵母粉。2.2g l氫氧化鈉溶液。3.乙酸。4.95 乙醇。5.5 磷酸。6.濃氨水。7.3，5 羥甲苯試劑 取比重1.19hcll00m1，加入fecl3...