３４樊瓊：中蜂囊狀幼蟲病毒多轉殖抗體的製備２０１４年第１期
樊瓊 ，費東亮 ，馬鳴瀟
（１．遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧
錦州１２１００１；２．遼寧省錦州市動物疫病預防控制中心，遼寧
錦州 １２１０００）
摘要：利用中蜂囊狀幼蟲病毒（ｃｓｂｖ）滅活疫苗作為抗原製備兔多轉殖抗體。利用ｒｔ－ｐｃｒ方法對疑似感染
ｃｓｂｖ的中蜂樣品進行檢測，檢測陽性後，經差速離心法純化ｃｓｂｖ，並用ｂｃａ方法檢測病毒濃度，將病毒濃度稀釋至
按稀釋後的ｃｓｂｖ體積的０．３％加入甲醛滅活進行滅活，製備ｃｓｂｖ油乳劑滅活苗，經無菌、安全性和穩
定性檢驗合格後，對紐西蘭大白兔進行３次免疫，每次間隔２周，對其產生的多轉殖抗體進行了ｓｄｓ－ｐａｇｅ分析和效
價檢測，結果表明製備的兔多轉殖抗體效價ｏｄ值最高可達到１．１０９。實現了中蜂囊狀幼蟲病毒高效價多轉殖抗體的
製備，為深入研究ｃｓｂｖ和綜合防治奠定了基礎。
關鍵詞：中蜂囊狀幼蟲病毒；滅活苗；多轉殖抗體
中圖分類號：￥８９５．１３３
文獻標識碼：ｂ
文章編號
ｆａｎ ｑｉｏｎｇ一
中蜂囊狀幼蟲病是由中蜂囊狀幼蟲病毒（ｃｓｂｖ）蜂囊狀幼蟲病防控措施主要採取化學藥物**和抗
引起的以蜂王產卵下降、老齡蜂死亡、幼蟲大量死病力強的蜂群育王繁殖等措施，但收效並不顯著。亡為特徵疾病ⅲ。一旦發生會對中蜂幼蟲造成毀滅隨著病毒學和免疫學研究不斷深入，利用生物製劑
性打擊，甚至引起整個蜂群毀滅。該病於１９７２年首為該病預防與**提供了新思路。目前對ｃｓｂｖ研究
次在廣東發生，隨後迅速蔓延至全國。２０１２年ａｉｈ僅侷限於一些毒株的測序，而對其分子生物學特等人通過對我國蜂病毒流**況調查，發現ｃｓｂｖ仍性、遺傳進化關係、對其病毒的免疫原性研究 ，然是阻礙中蜂業發展的首要原因 。目前，針對中相關報道較少，僅有利用ｃｓｂｖ結構基因進行蛋白表
收稿日期
作者簡介：樊瓊（１９８７一），男，碩士，主要研究方向分子病毒學。通訊作者：馬鳴瀟（１９７３－），男，博士，教授，主要研究方向分子病毒學。
**專案：國家自然**遼寧省人力資源和社會保障廳
２０１４年第１期
達製備抗血清的報道 ，但抗原為部分結構蛋白，計了１對引物，送至大連寶生物工程****合
產生的抗體水平較低。本研究以滅活的ｃｓｂｖ作為抗成。引物序列如下：原，製備兔多轉殖抗體，為研製中蜂囊狀幼蟲病的ｆ：５』一一３』深入研究和綜合防治奠定基礎。
ｒ：５』一
１材料與方法
１．１．３主要儀器
高速冷凍離心機，中試管７支槍式
１．１試驗材料移液管，ｐｃｒ儀，恆溫水浴箱，７２２０型分光光度計
１．１．１病料與試驗動物
錦州周邊蜂廠疑似患中蜂１．２試驗方法
囊狀幼蟲病毒病病蜂；８只雄性健康紐西蘭大白兔體１．
２．１病料採集與檢測將疑似感染ｃｓｂｖ的中蜂樣
重１．５左右。
品，用ｔｒｉｚｏｌ提取病毒總ｒｎａ，並以病毒總ｒｎａ為模
１．１．２試劑配製及引物設計
試劑ａ：１％ｂｃａ二鈉板，利用本實驗室建立的ｒｔ－ｐｃｒ方法對進行檢測」
。鹽，２％無水碳酸鈉，０．１６％酒石酸鈉，０．４％氫氧化ｐｃｒ產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增結果。
鈉，０．９５％碳酸氫鈉，混合調ｐｈ值至１１．２５；試劑１．
２．２病毒的純化參照馮建勳等方法，對感染
ｂ：４％硫酸銅；ｂｃａ工作液：試劑ａ １００ ｍｌ＋試劑ｂｃｓｂｖ的幼蟲進行超速離心得到足夠濃度和高純度
２ ｍｌ混合：蛋白質標準液：用結晶牛血清白蛋白根的病毒。
據其純度用生理鹽水配製成１．５ ｍｇ／ｍｌ的蛋白質標１．
２．３病毒蛋白濃度測定利用ｂｃａ法檢測濃度，
準液，ｐｈ＝７．６磷酸鹽緩衝溶液、氯仿、甲醛、吐首先取７支試管標號如表１所示加入試劑，混勻後
溫一８０、司本一８０、１０號白油探針、
３７℃下保溫３０ ｍｉｎ，在５７０ ｎｍ測ｏｄ值並計算濃
和顯色液。
度。根據ｇｅｎｂａｎｋ中ｃｓｂｖ基因組序列及有關文獻設
表１病毒蛋白濃度測定
１．２．４病毒的滅活用ｐｈ ７．６磷酸鹽緩衝液將ｃｓｂｖｉ．２．７試驗動物的免疫
用製備好的疫苗用來免疫４
濃度稀釋至按稀釋後的囊狀幼蟲病毒只雄性體重在１．５ ｋｇ的紐西蘭大白兔編號為ｒ１、
體積的０．２％加入甲醛滅活２４ ｈ 。
ｒ２、ｒ３、ｒ４，基礎免疫採用皮下注射免疫，共注射６１．２．５疫苗的製備滅活後的病毒按體積比的４％ｄｎ
點，每點注射０．２ ｍｌ，分別間隔２週後進行二免和
。入吐溫一８０，做水相；司本－８０與１０號白油按體積比三免，並在初免後的７ ｄ後利用間接ｅｌｉｓａ法檢測抗１：１４混合，在１２１．３℃溫度下滅菌，做油相；水相體效價，當效價達到一定值，不再上公升時，於兔耳與油相體積比為２：
３，先將油相在攪**動脈大量取血，取得血清一２ｏ℃儲存備用。拌，再緩慢加入水相攪拌法檢驗血清中的ｉｇｇ按照ｌａｅｍ
１．２．６疫苗檢驗
對製備疫苗進行無菌檢驗、完全ｍｌｉ體系，分離膠ｌ２．５％，電壓１３５ ｖ，時間２ ｈ，考
滅活檢驗、安全性檢驗和離心穩定性試驗。
馬斯亮藍－ｒ２５０染色。
２０１４年第１期
３討論製備高效價抗體是示蹤基因表達和研究基因功能的前提。多轉殖抗體雖然在特異性、穩定性方面不如單轉殖抗體，但其製備簡便、成本低廉、具有
多個與抗原決定簇結合的位點，使其大量應用於免疫學研究 。對於ｃｓｂｖ的免疫學研究尚處於起步階
段，對其免疫原性的結構蛋白尚不清楚，給相關研究帶來困難。同時，昆蟲類動物缺乏哺乳動物所具
［３］張琳，錢愛東，毛靖宇．中蜂囊狀幼蟲病毒ｌｎ—ｑｙ株ｖｐ
２結構蛋白的基因分析及ｂ細胞抗原表位**［ｊ］．遼有的獲得性免疫系統，只能通過天然的免疫系統抵制各種病原微生物的侵染 「 。因此，利用兔子製備ｃｓｂｖ多轉殖抗體的成功，給ｃｓｂｖ免疫學研究提供
了新的思路。
另外，隨著化學抗病毒藥物帶來的諸多弊端被人們所認識，科學家正致力於尋找新型抗病毒製劑，多轉殖抗體具有廉價、安全、有效、易獲得等優點，且不存在藥物殘留和耐藥性等問題，非常符合我國畜牧業生產的實際，可廣泛應用於動物疾病的預防、診斷和**，具有較廣闊的市場開發和綜
合利用的前景 。本試驗利用ｃｓｂｖ純化毒製備的滅活疫苗免疫大白兔製備了ｃｓｂｖ多轉殖抗體，具有較高效價，為ｃｓｂｖ的深入研究、血清學調查、試劑盒的研製和ｃｓｂｖ**性生物製劑開發等奠定了基礎。
４結論通過本試驗，成功製備了兔抗ｃｓｂｖ的多轉殖抗體，經ｅｌｉｓａ檢測有較高效價，為深入研究ｃｓｂｖ提供了條件。
參考文獻
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（編輯：張婷婷）