1. 對目的片段進行pcr擴增：
pcr體系：（50l）
dna template10-100ng
10×pcr buffer5l
50mm dntps0.5l
primers1m each
wateradd to 49l
taq polymerase1l
2.瓊脂糖電泳，看有無目的條帶
3.對目的條帶進行切膠**
4.對pcr產物加尾: 72℃，20min（如用高保真酶，則需加尾；taq酶，則無需加尾）
加尾體系：（10l）
膠**dna8l
buffer1l
dntpmix0.5l
taq polymerase0.5l
5.t載體連線：室溫，30min
體系：（6l）
加尾後產物4l
t載體1l
salt solution1l
6.30-40l感受態加入重組後的質粒。
7.放冰上30min。
8.42℃熱擊90s（放冰上冷:1-2min）9. 加soc（200-250l）
10.37℃，300rpm，1h
11.平板塗佈：加氨苄的培養基，37℃培養箱倒置培養過夜12.挑單菌落：用牙籤挑單菌落，放到含6ml液體培養基的試管中，37℃搖床培養過夜
13.試劑盒提質粒
14.酶切：37℃，2h
體系：（20l）
buffer22l
酶0.5l
模板1l
bsa0.2l
h2o16.31l
15.瓊脂糖凝膠電泳分析是否正確匯入目的片段鑑定陽性轉殖的另乙個方法----菌落pcr從平板挑單菌落到含1ml lb（amp+）的1.5drof管中，37℃搖床培養8小時左右，進行菌落pcr鑑定，引物可選用載體的通用引物，如t載體用m13f/r。
菌落pcr體系（20ul）
10*taq buf 2ul
dntps（2.5mm）1.6ul
mg2+（25mm） 1.6ul
primer f（10um） 0.5ul
primer r（10um） 0.5ul
dna1 ul
ex taq 0.3 ul
ddh2o 12.5ul
程式：94度10min
94度 30sec
56度 30sec
72度 2:10 30cycle
72度 10min
4度 forever
質粒轉殖等實驗
1.pcr反應 取1 l逆轉錄產物為模板，在25 l pcr擴增反應體系中先將模板於97 變性5 min 熱啟動過程 加入taq dna 聚合酶，在pe 2400 pcr熱迴圈儀中迴圈35次。pcr反應體系 ddh2o15.5 l 10緩衝液2.5 l mgcl21.5l dntps 2.5 mmo...
基因的轉殖 表達 檢測原理步驟
應用於植物病原檢測的實時螢光定量pcr 張艷傑植物病理學 20131130029 摘要 實時螢光定量pcr技術是這些年興起的可以定量dna的新技術，廣泛應用於植物病原檢測 轉基因檢測 訊號轉導 植物抗病檢測 微生物指標等 本文綜述了實時螢光定量pcr技術的原理及其在植物病原菌檢測中的應用。關鍵詞 實...
酶解實驗步驟
第四節 凝膠蛋白質點的酶解 一.蛋白質點酶解 準備工作 1 檢查凍乾機，調好水浴鍋 37 56 2 檢查各種試劑的量是否足夠 dtt iaa nh4hco3 3 檢查酶解房衛生狀況 每一步注意事項 1 每一步加入的液體量視膠塊大小定，一般是50ul 管 2.每次 後隨手甩一下，以便把膠塊和管壁上的液...