1.切片常規脫蠟至水化：
燒片80oc，1h；
松節油i 20min，ii 15min；
100%乙醇i 8min，ii 5min；
95%乙醇i 5min，ii 5min；
75%乙醇 i 5min，ii 5min；
蒸餾水 5 min x3;
pbs 5min x1.
2.失活內源性過氧化物酶
3% h2o2 37oc 20min;
pbs 5min x3；
甩乾。3.抗原修復
a 9ml+b 41ml+450ml 水（檸檬酸緩衝液）400ml（360水+40）
或：tris-edta 修復
水浴98oc 15min；
室溫冷卻；
pbs 5min x3 甩乾
4.血清封閉
37oc 30min；
甩乾，不洗。
5.一抗（1:200稀釋）4oc過夜（或室溫2-3h），對照加pbs（稀釋比例，**）
5min x4；
二抗37oc 30min；
pbs 5min x3
染色sabc稀釋100倍；990ul pbs +10ul sabc
或三抗孵育 37oc 30min.
染色1ml 水中加1滴a搖勻，加1滴b和1滴c後搖勻，室溫1-2min。
水：雙蒸水；a：濃縮緩衝液；b: dab；c：h2o2
現配現用，配好後遮光，30min內使用，剩餘棄去。
9.復染
清水沖洗，浸於蘇木素中1min
清水沖洗，鹽酸酒精（1ml hcl，100ml 95%酒精）幾秒鐘
返藍：清水沖洗10min。
10.脫水
75%酒精1min；
85% 1min；
95% 1min；
100% 4min。
11.晾乾後封片，標記，觀察，截圖，分析。
常用單位換算
1m=1mol/l;
1um=1umol/l;
5%瓊脂溶液：稱取5g瓊脂粉溶於100ml生理鹽水。5%為質量分數單位，以1l水為1kg算，則5g每100g即5g每100ml。
免疫印跡常用抗原分子量
gapdh 36kda
igf 95kda
rna提取
準備試劑：氯仿，異丙醇，rnase-free-ddw(depc水)，75%乙醇（ddw配製）。
1. 樣品處理
1）樣品處理：取新鮮或-70℃凍存組織，每30-50mg組織加入1ml trnzol-a+,勻漿處理，樣品體積一般不要超過積的10%；
2）單層培養細胞：移出培養基，pbs沖洗，加入trnzol-a+裂解細胞，每10cm2面積加入1ml trnzol-a+;
2. 將勻漿或裂解細胞在15-30℃放置5min，輕輕吹打，使核酸蛋白複合物完全分離；
3. 4℃，1400rpm離心，10min，取上清置-80℃凍存；
4. 每1mltrnzol-a+對應至少0.2ml氯仿，蓋好瓶蓋，劇烈**15s, 室溫放置3min；
5. 4℃，1400rpm離心，10min，樣品會分為三層：黃色有機相，中間層和上層無色水相；rna主要在水相中，把水相（約500ul）轉移到新管中。
在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20-30min；
6. 4℃，1400rpm離心，10min，去上清，離心後rna位於管壁一側底部形成膠水樣沉澱；
7. 加入1ml75%乙醇（depc水配製）洗滌沉澱。1ml trnzol-a+對應1ml75%乙醇；
8. 4℃，1400rpm, 10min,傾出液體，剩餘的少量液體短暫離心，然後用槍頭吸出，注意不要吸到沉澱；
9. 室溫倒置ep管晾乾，加入50ulddw，反覆吹打，混勻，充分溶解rna。
western blot 分離膠：
下層分離膠10ml：
上層濃縮膠5ml：
厚板是上述的1.5倍：
下層分離膠15ml：
上層濃縮膠7.5ml：
running buffer(10x, 1l)
加入ddw補齊到1l。
小分子（＜180）trans buffer(10x, 1l)
加入ddw補齊到1l。
稀釋用trans buffer(1x, 500ml)
加入ddw350ml補齊到500ml。
大分子（＞180）trans buffer(1x, 500ml)
加入ddw補齊到500ml。
大分子（＞180）trans buffer(1x, 600ml)
加入ddw補齊到600ml。
pbs配方1l（細胞室用）：
加入ddw補齊到1l，濾過。
pbs buffer 1l：
加入ddw補齊到1l。
tbs （10x, 1l）
加水補齊到1l。
稀釋用tbst（1x, 1l）
bsa buffer 5%：
加入50ml的大離心管中溶解，以後分裝使用。
nan3 濃度：0.02%（g/ml）.
一抗：1:1000配製，加入12ml的小離心管中。
gapdh 1:20000配製。
二抗：1:25000或1:30000稀釋配製, 加入50ml的大離心管中溶解。
穩定transfection
帶gfp的報告質粒 luciferase報告質粒
g418篩選
1. 預實驗 g418濃度；
2. 預實驗及轉染後消化鋪板的密度相近；
3. 正式實驗過夜，加入g418，大量死亡很正常；
4. 有限稀釋法， 12小時後觀察可能出現單個細胞的孔，標記；
5. 2-3天對標記的孔要格外關注；
6. 10天，將長的足夠大的單右要小心消化下來， 至24孔放大。
免疫共沉澱
1. 種板，6孔板，3.5皿，80-90%，處理；
2. 傾去培養基，預冷pbs沖洗兩遍；
3. 加500ml ip buffer（提前加蛋白酶抑制劑），冰上裂解15min，使刮刀；
4. 離心 1000r/5min（4℃最好）；
5. 取上清200ul至新ep管中，剩餘凍存；
6. 200ul+1ug一抗，4℃孵育2-4h；
7. 加珠子7ul，4℃，孵育過夜。
次日8. 離心3000r/3min，小心傾去上清，用pbs洗3次（避免劇烈**）；
9. 10-30ul上樣緩衝液（2.5x, 20ul）。
轉染transfection
電擊法，磷酸鈣法，脂質體法，病毒介導法
真核細胞由於外源dna摻入而獲得新的遺傳標誌的過程
1. 瞬時轉染，不整合，高水平表達，僅數天，多用於啟動子和調控元件的分析，超螺旋dna。
2. 穩定轉染，整合，低水平，持久，線性dna。
mtt分析法吸光度0-0.7之間，否則不是直線關係
以活細胞代謝物還原劑mtt噻唑藍為基礎，mtt為黃色化合物，是種可以接受氫離子的染料，作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素c的作用下四唑環開裂，生成藍色的formazan(甲瓚) 結晶，其生成量僅與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將mtt還原）。formazan結晶可溶解於含50%的n,n-二甲基醯胺和20%的十二甲基磺酸鈉（ph4.7）的mtt或dmso，用酶標儀測定490nm處的光度值od值，以反映出活細胞的數目。
步驟：1. 接種細胞：用含10%fbs培養基配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul；
2. 培養細胞： 同一般培養條件，培養3-5天（根據實驗目的和要求定）；
3. 呈色：培養之後，每孔加dmso 200ul，**10min，使結晶充分溶解
4. 比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光的值。
transwell
1. transwell 小室製備
無基質膠transwell小室製備。1）包被基質膜；2）水化基質膜。
有基質膠transwell小室製備。
2. 製備細胞懸液
無血清培養基飢餓12-24h，去除血清的影響；
消化細胞，終止消化後離心棄去培養液，用pbs洗1-2遍，用含bsa的無血清培養基重懸，調整密度至1-10x105；
3. 接種細胞
取細胞懸液100-200ul加入小室；
下室加500ul含fbs或趨化因子的培養基；
培養細胞；
4. 結果統計
直接計數：貼壁細胞計數，非貼壁細胞計數；
間接技術：用於穿過細胞過多時。
基因敲除
sirna(small interfering rna, 小分子干擾rn**段)：雙鏈rna經酶切後會形成很多小片段，其一旦與mrna中的同源序列互補結合，會導致mrna失去功能，即不能翻譯產生蛋白質，也就是基因沉默。
rnai(rna interference) ：雙鏈rna對基因的表達的阻斷作用。
實驗操作步驟和注意事項
1 全開實驗裝置主管道上所有閥門 閥2 閥4 閥5和閥10 全關倒u型差壓計上的閥門，將流向轉換器的出口轉向排水側，開啟管道幫浦。2 孔板流量計的標定 2.1開啟管道幫浦約5分鐘後，關閉閥4 閥10，開啟與孔板流量計相連的倒u型差壓計9上的閥門a2 b2和d2 當a2 b2和d2的手柄處於水平位置時...
小學科學實驗操作步驟
小學科學3 6年級實驗操作步驟 三年級上冊 一 實驗名稱 比較材料的軟硬 實驗目的 材料的硬度越大，就越能防止別的物體破壞它的表面。用簡單測量的方法檢驗材料的物理性質，通過比較發現材料的不同物理特性。實驗材料 木片 紙片 金屬和塑料片各兩個 操作步驟 1 用一根木條分別去刻畫另一根木條 卡紙 鐵片和...
FISH操作步驟
樣品的預處理 1.取反應泥水混合物2ml 可視mlss的量來決定所取樣的多少 至離心管 2.離心 10000r min 5min,去上清液，加入1pbs緩衝液1ml重懸，重複操作兩次 3.加入1ml4 的多聚甲醛溶液重懸，放置於4攝氏度固體2小時 4.樣品離心 10000r min 5min,去上清...