（2008/11/7整理，zlj）
原理：trizol是由酚與異硫氰酸胍組成的均相溶液，酚起到變性的作用，使蛋白變性，異硫氰酸胍可以抑制rna酶，防止rna的降解。
（一） 試劑準備
1． trizol試劑
2． 氯仿、異丙醇、無水乙醇（國產色譜純）
3． 三蒸水（娃哈哈）
4． 75%乙醇（depc h2o配製）
(用於擦槍等) 0.1%depc h2o配製。無水乙醇500ml,倒出200ml，加入100ml的0.1%depc h2o。
（用於rna洗滌）0.01%depc h2o配製。無水乙醇500ml,倒出200ml，加入100ml的0.01%depc h2o。
5． depc h2o
0.1%depc h2o(用於處理槍、槍頭盒)。用三蒸水配製。加入體積0.1%的depc
0.01%depc h2o (用於rna提取最後一步)三蒸水配製,加入體積0.01%的depc.蓋上膠塞,過夜,高壓滅菌.
6． pbs配製100ml，專門用於該實驗。
7． te緩衝液
8． 反轉錄試劑盒（mbi）
9． taq 酶 ——耐熱dna聚合酶（takara japen）
10． dntps (takara japen)
11． 溴酚蘭
12． marker
（二） 耗材準備
1． rnase-free塑料ep管。直接使用。
2． 一次性pe手套（3包）
3． 三種規格槍頭
處理：槍頭及槍頭盒，鑷子、及4ml國產ep管放入飯盒中，加入0.1%depc h2o，浸入後，蓋厚紗布，將處理的物品壓入水中，蓋上飯盒蓋，自封袋封好，室溫過液。
烘乾。滅菌30分鐘。
（三） rna提取
一步法提取細胞總rna
準備試管架、1.5ml ep管架、2套1.5mlep管、4ml處理過的ep管（數目同樣品數）
所有ep管標號
1． 收穫細胞，移入4ml離心管（處理過）中，1000轉離心5min，pbs洗一遍。
2． 每加入1ml trizol, 槍頭反覆吹打，移入1.5mlep管中，室溫靜置5min。不能隨意增加樣品量或減少trizol 量，否則會使內源性rnase的抑制不完全，導致rna降解。
3． 加氯仿200微公升，蓋好，劇烈**15秒。室溫放置2-3分鐘，4℃12000g離心15分鐘。
4． 仔細吸取上層水相（約500μl,槍調到170μl，吸三次），移到另一套1.5mlep管中。
5． 加500微公升異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min.
6． 4℃離心，12000g，10min, 棄上清。
7． 加入1ml 75%乙醇（0.01%depc處理過的），輕輕洗滌沉澱。4℃, 7500g, 離心5min。
盡可能吸走上清液
8． 室溫下揮幹（5-10分鐘），注意不能完全乾燥。加0.01%depc h2o 40μl, 吹打溶解，56℃水浴助溶10分鐘。-70℃冰箱儲存。
（四） 紫外吸收測定法分析rna濃度、純度
rna定量方法與dna定量相似。rna在260nm波長處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長分光測定rna濃度，od值為1相當於大約40μg/ml的單鏈rna。
如用1cm光徑，用depc h2o稀釋dna樣品n倍並以depc h2o 為空白對照，根據此時讀出的od260值即可計算出樣品翻譯前的濃度。
操作步驟：
用depc h2o種類稀釋rna（稀釋600倍），即吸收10μlrna，加入te溶液1990，稀釋200倍，讀取其在分光光度260nm 和280nm 處的吸收值，以depc h2o調零。
樣品rna濃度（μg/ml）計算公式為：a260×稀釋倍數×40μg/ml，根據rna濃度測定的結果將總rna配製成1μg/ml。（a260*8μg/μl）用0.
01%depc水稀釋成1μg/μl的樣品rna濃度
rna溶液的a260/a280的比值檢測rna純度，比值範圍應在1.8-2.1之間。若比值較低，說明有殘餘蛋白質存在；比值太高，則提示rna有降解。
（五） rt合成cdna第一鏈（按照試劑盒操作說明進行，mbi）
1． 採樣品總rna 2μl
隨機引物 1μl
加depc h2o（9μl）到總體積12μl
離心3-5秒（掌上離心機）
2． 65℃，5分鐘；0℃ forever
離心3-5秒
3．冰上操作 （以下事先混合好，分別加入各種樣品中8μl）
加入5×reaction buffer4μl
ribonlocktmribonuclease inhibitor 1μl
10mm dntp mix2μl
revertaidtmm-mul v reverse transcripase 1μl
6. 25℃ 5分鐘，42℃ 60分鐘
7．70℃ 5分鐘， 4℃ forever。
cdna儲存在-20℃冰箱裡。
（六） pcr 反應及檢測
pcr擴增反應體系25μl：（按照順序加入pcr管中）
1st strand cdna 1μl
以下配好後，一起加入24微公升
10×pcr buffer 2.5μl
dntp mix 2μl (2.5mm×2μl)
引物（含目的基因及dapdh上、下游引物10pmol）1μl（80微公升0.01%depc,上下游引物分別加10微公升）
taq dna polymerase 1.25units 加入0.25微公升
三蒸水補足至25μl（18.25微公升0.01%depc）
取出後暫放4°冰箱儲存。
摸索條件：如果條帶拖尾，應增加退火溫度；沒有條帶是，降低退火溫度。可設定梯度公升溫程式，摸索哪個溫度最適合。
（七） 瓊脂糖凝膠電泳及半定量分析
配膠：稱0.6克瓊脂糖，加50毫公升dpe水（稍微多一些，因加熱時水分會蒸發，待膠澄清透明，晃動後從底下產生氣泡，恰好）。
等膠不燙手時加eb 2.5微公升。放好梳子，倒膠，趕氣泡，40分鐘後，拔梳子。
將膠放到電泳緩衝液中，上樣，跑電泳，90v 20分鐘。紫外燈下拍照。
取pcr擴增產物5μl，加入溴酚藍1μl，於含0。5μg/ml 溴化乙啶（eb）的1.2%瓊脂糖凝膠電泳，擴增條帶與標準dna分子量條帶比較。
quantity one software分析、讀取目的基因和gapdh條帶的光密度值，通過計算iod（目的基因）/iod（gapdh）的比值，從而得到目的基因的相對表達豐度。
（三）注意事項
1．樣品量和trizol加入量一定要按照步驟（1）的比例，不能隨意增加樣品量或減少trizol量，否則會使內源性rnase的抑制不完全，導致rna降解。
2. 實驗過程中必須嚴格防止rnase的汙染。
知識補充：
焦碳酸二乙酯（depc）：depc即diethypyrocarbonate，
depc結構式
中文名為焦碳酸二乙酯。分子式為c6h10o5，分子量為162.14。
是一種強烈但不徹底的rna酶抑制劑。它通過和rna酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。depc可以抑制植物細胞上的nscc，即nonselective cation channel （非選擇性陽離子通道）。
是常用的nscc抑制劑.
FISH操作步驟
樣品的預處理 1.取反應泥水混合物2ml 可視mlss的量來決定所取樣的多少 至離心管 2.離心 10000r min 5min,去上清液，加入1pbs緩衝液1ml重懸，重複操作兩次 3.加入1ml4 的多聚甲醛溶液重懸，放置於4攝氏度固體2小時 4.樣品離心 10000r min 5min,去上清...
操作步驟參考
1.對正文進行排版，其中 1 章名使用樣式 標題1 並居中 編號格式為 第x章，其中x為自動排序。操作步驟 把游標定位在第一章前，點選 格式 選單下的 樣式和格式 在右面的 樣式和格式 窗格中右鍵點選 標題1 選擇 修改 在 修改樣式 對話方塊中選擇 居中 點選 樣式 選擇 編號 在 專案符號和編號...
LMT操作步驟
第一部分 配置檔案的製作 1.開啟lmt 軟體，選擇離線配置模式，密碼111111 2.右鍵點選lte裝置，選擇開啟初配檔案，選擇d 配置檔案 3.對檔案進行配置，主要引數如下 1 局向 管理站資訊 操作維護鏈路 2 傳輸管理裡面的sctp鏈路，ip位址和路由關係 3 小區和小區網路規劃的引數配置。...