一、實驗器具與材料：
1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸頭：1ml、200μl、20μl
3、勻漿管：5ml
4、吸頭臺：放置1ml吸頭的乙個，放置20μl吸頭的乙個
5、ep管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）
1個125ml的白色試劑瓶（放無水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、試管架：5ml、1.5ml、20μl
10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個備用，乙個裝無水乙醇，另乙個裝depc水
11、鋁製飯盒：4個
12、塑料小飯盒：1個
13、大瓷缸：2個
14、錫泊紙：一捲
15、捲紙：2卷
16、三角燒瓶：帶蓋，稍大
二、實驗器具的處理與準備
1、塑料製品：（包括槍頭、ep管、勻漿管等）
先將depc水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料製品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入depc水，過夜，然後高壓，再烤乾備用，實驗前將槍頭等放入吸頭臺，再高壓一次（ep管）
2、玻璃製品：泡酸過夜，沖洗乾淨，蒙錫紙烤乾備用（depc水泡）（洗淨後先泡1‰depc過夜，再烤乾）
3、勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗淨後，再高壓（不需要泡depc）
三、試劑配製：
1、depc水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰depc水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。
2、75%乙醇：用無水乙醇+depc水配，然後放-20℃儲存（其中depc水需先高壓）
3、異丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、瓊脂糖
四、幾種緩衝液的配製：
1、電泳緩衝液：
tris 54g
硼酸 27.5g
0.5m edta 20ml？ ph8.0
蒸溜水 1000ml
5×tbe （貯存液）
再將5×tbe稀釋10倍成0.5tbe就可以在電泳時使用（即工作液濃度），如取50ml貯存液+450ml水——→500ml工作緩衝液
2、上樣緩衝液：
0.25%溴酚藍
0.25%二甲苯青ff
30%甘油
6×緩衝液，4℃儲存
五、瓊脂糖凝膠的配製：
1、1.0%：
1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩衝液，微波爐中火30秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60℃時加入10mg/ml溴化乙錠2.5μl，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min後現進行電泳。
2、1.5%:
同上，將瓊脂糖的量改為1.5g
六、需購置的rt-pcr材料：
（生工. tel. 2236106.）
taq酶（含mgcl2 buffer） 200u 70.00
dntp: 1支
oligo(dt)15: 1 od 40.00 promega
m-mlv: 1支 250.00 promega (buffer)
rnasin: 1支 110
—— -20℃
depc 5g 110.00
trizol 100ml/1瓶 invitrogen life technologies
—— 4℃
marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
（1543. 994. 697. 515. 377. 231）
七、引物合成
1、內參照：
gapdh
正義：5′—accacagtccatgccatcac—3′
反義：5′—tccaccaccctgttgctgta—3′
β-actin
正義：5′—cacgatggaggggccggactcatc—3′
反義：5′—taaagacctctatgccaacacagt—3′
2、par-4:
正義：5′—gggacctcggaactcaac—3′
反義：5′—tgtatctgcctgggactg—3′
3、退火溫度計算
2（a+t）+4（g+c）
正反義平均數，再上下波動度（±4℃，或±5℃）
4、引物各合成5 od，每od一瓶分裝好
5、引物稀釋：
加depc水量為（μl）
= ? nmol / od × 管上所標od數×100
是為10p mol / μl 濃度的引物溶液
八、pcr產物電泳
先將1-10μl左右pcr產物，加已點在紙上的溴酸蘭，反覆吸打混勻後進行電泳，一般電流為10ma，電源100v，電泳30分鐘，紫外燈下觀察，滿意的結果掃瞄列印。
九、幾個注意點：
1、逆轉錄的關鍵步驟是立即冰水浴？
2、rt時，先開啟pcr預熱30分鐘。
3、rna抽提前，開啟離心機預冷。
[, , ]
組織100mg
↓加1mltrizol
↓勻漿（要徹底，後轉至ep管）
（組織勻漿量》100mg時分裝1ml/每ep管）
↓顛倒混勻10下，室溫5分鐘
↓加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）
↓顛倒混勻10下，室溫5分鐘
↓4℃，離心12000g，15分鐘
↓轉上層水相（約400μl）於另一1.5mlep管中
↓加等體積異丙醇（約400μl），混勻室溫10分鐘
↓4℃，離心12000g，10分鐘
↓棄上清
↓加冰預冷的75%乙醇（用depc水配）1ml
↓4℃離心7500g，5分鐘
↓棄上清，空氣乾燥5-10分鐘（不能完全乾燥）
↓溶於depc水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）
注：1、rna若用於核酸轉移應溶解於樣本緩衝液中，否則depc溶解
2、細胞組織加trizol勻漿後，可在-60℃放置至少乙個月（甚至可一年以上）
3、rna在75%乙醇中，2-8℃至少可儲存一周，-20℃至少可儲存一年
[, ]
（第一步：逆轉錄反應）
（稀釋10倍後用）
↓混勻，離心，70℃ 5min
↓立即冰水浴，稍離心
↓總體積40μl（20μl）
↓混勻，離心，42℃ 60min
↓95℃ 10min（破壞mlv）
↓4℃儲存
[, ]
（第二步：pcr反應）
總體積20μl(50μl)↓混勻
↓97℃，5分鐘
↓立即冰水浴↓混勻
↓三、電泳：
加1-10μl pcr產物+溴芬蘭（1-2.5μl）混勻，加樣，電泳。
注意：taq酶、m-mlv、rnasin等-20℃儲存，操作時置於冰上。dntp勿反覆凍融。
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