第四節:凝膠蛋白質點的酶解
一.蛋白質點酶解
準備工作：
1． 檢查凍乾機，調好水浴鍋（37℃，56℃）
2． 檢查各種試劑的量是否足夠（dtt iaa nh4hco3）
3． 檢查酶解房衛生狀況
每一步注意事項：
1．每一步加入的液體量視膠塊大小定，一般是50ul/管
2. 每次**後隨手甩一下，以便把膠塊和管壁上的液滴甩下來
3. 每次開啟ep管蓋子前，確認膠塊在管內，並將膠塊甩至管底。開蓋子動作盡量輕巧，以免膠塊彈出。
4．在凍乾樣品後，要確保樣品在管底，以防樣品與封口膜一起被去掉。
酶解前配製
1）、100 mmol/l的nh4hco3
參考配製10ml 稱79.06mg nh4hco3 溶於10ml水中
以後每一步25 mmol/l的nh4hco3可用100 mmol/l的nh4hco3稀釋。
2）、1mol/l的dtt
參考配製10ml 稱1.55gdtt溶於10 ml水中，1ml分裝，避光貯存（錫箔包），-20度永久儲存
酶解步驟: 調水浴鍋到37℃以便做脫色用，此外，調水浴鍋到57℃，以便做還原用。
1. 沖洗膠塊：用水洗衣膠塊2次，
2. 脫色：用含有25mmol/l的nh4hco3的50%的乙腈37℃保溫30min。如第一次脫色不完全可再脫一次
3.乾燥：吸出液體後，先加50%乙腈，再加100%的乙腈 。
4．還原：加入還原劑，封口，57℃水浴一小時，還原蛋白質。
還原劑：25mmol/l的nh4hco3（含10mmol/l dtt）
參考配製方法（4ml）：6.2mgdtt溶於4ml 25mmol/l的nh4hco3中
注意事項：1. 注意在水浴鍋上寫紙條標明使用者名字，水溫和使用的時間段，方便實驗之間的協調和發生停電等意外情況時別的同學幫助臨時處理樣品。
2．水浴鍋用完後恢復到還原前的初始狀態，以免後來的同學做實驗時因為習慣或者經驗忽略此處造成不必要的失誤。
5．烷基化將樣品從水浴鍋中取出後，室溫冷卻，去掉液體，迅速加入同樣體積的烷基化試劑室溫暗處放置45min，使之碘乙醯胺化。
烷基化試劑：25 mmol/l的nh4hco3（含55 mmol/l iaa）
參考配製方法（4ml）：40.69mg iaa溶於4ml 25 mmol/l的nh4hco3中
注意事項: 1、樣品多的時候，可以將先加了烷基化試劑的樣品先放入暗處，並記住放入順序和時間，以便取出時按時間順序處理。
2、注意實驗時暗處的衛生情況，應該放在乾淨處，且建議在取出後先用酒精把樣品盒擦拭後再做後續實驗。
6． 反應完成後去掉液體，依次用25mmol/l的nh4hco3溶液，50%的乙腈，100%的乙腈沖洗膠塊，每次振盪後放置10min，去掉液體。
7．重複6的操作。
8．去掉液體後，用封口膜封口，扎孔，凍乾30min，注意該步要完全凍乾,這對蛋白質點的酶解很重要。（乙腈效果好可不需此步）
9. 酶解每管加入適量（約25ul）的酶液（切膠儀切的膠塊每管加4ul酶液），冰上放置30min(吸脹就好，時間自己控制)。
取20ul 1mm hcl加入trypsin酶中，得1ug/ul的原液,按2ul每管分裝
每2ul酶液用98ul覆蓋液（10%乙腈，25mmol/l的nh4hco3）稀釋到
0.02ug/ul（即20ug酶稀釋到1ml），現用現配。
參考覆蓋液配製（2ml）100mmol/l nh4hco3 500ul
100%乙腈200 ul
雙蒸水1.3ml
注意事項：酶從冰箱取出後所有操作過程，包括樣品加酶後，都要放到冰上。
10．檢查酶液吸脹情況，多餘的酶液吸走，酶液不夠，即膠塊中仍有白色，則再加入適量酶液。
11．加覆蓋液80ul封口，37℃保溫16-18小時。
蛋白質酶解後樣品的提取
1. 將樣品從37度水浴鍋中取出後，1%終止酶解。10000 g/1 min.
2. 將上清轉移到乾淨的ep管中。
3. 在剩餘膠塊中加入萃取液（2.5 % tfa ,67% acn for maldi ,5% formic acid 67% acn for esi）,37%保溫30min。
4. 超聲15min，間隔5min重複超聲 15 min 。水溫不超過40度。
5. 10000 g/1min，合併上清。
6. 冷凍離心乾燥至2-5 ul供質譜檢測。
二. 銀染蛋白質點酶解
準備工作：
4． 檢查凍乾機，水浴鍋能否正常使用
5． 檢查各種試劑的量是否足夠
6． 檢查酶解房衛生狀況
每一步注意事項：
1．每一步加入的液體量視膠塊大小定，一般是50ul/管
2. 每次**後隨手甩一下，以便把膠塊和**在管壁上的液滴甩下來
3.每次開啟ep管蓋子前，確認膠塊在管內，並將膠塊甩至管底。開蓋子動作盡量輕巧，以免膠塊彈出。
4．在凍乾樣品後，要確保樣品在管底，以防樣品與封口膜一起被去掉。
酶解前配製100 mm的nh4hco3
參考配製10ml 稱79.06mg nh4hco3 溶於10ml水中
以後每一步25 mm的nh4hco3可用100 mm的nh4hco3乙份，加3份水稀釋。
酶解步驟：
1. 水洗：用雙蒸水洗銀染以後的膠, 搖床上洗2-3次,每次10分鐘
2. 成像，取點 （如果還沒有成像的話，以及用自動取點儀操作時，但一般情況下，膠是做完後便要掃瞄的）
3. 脫色，水洗
脫色工作液：30mmol/l k3fe(cn)6 : 100mmol/l na2s2o3=1:1
參考配製方法（4ml）：2 ml 30mmol/l k3fe(cn)6（稱19.8g k3fe(cn)6溶於2ml便配成30mm的溶液）：
2ml 100 mmol/l na2s2o3（1ml amersham公司銀染試劑盒中的5％na2s2o3加1ml 雙蒸水）
注意事項：每次加5個樣，加完脫色液後**，置白紙上觀察，顏色脫去後馬上加水200ul沖洗停止反應，**， 2分鐘內吸出，再加200ul水，**，直到完全洗掉脫色液顏色（膠變得透明）。
4. 加入50%乙腈，**，洗1-2遍，每次15min
5. 脫水：100%乙腈脫水至膠塊變成白色，若**後一次反應膠塊沒有變白，可將乙腈吸出，再加入100%乙腈脫水一次。
6. 吸脹：加入25mm的nh4hco3**後靜置吸脹5min，再吸出。
7. 脫水：同步驟5
8. 凍乾：用封口膜封口，扎孔，凍乾機中凍乾20min,取出時輕敲ep管底，其中白色膠塊在管中輕快跳躍即可
注意事項：注意凍乾機靠右邊的按鈕打到「low」一檔，在操作過程中有不小心把該擋碰到「high」一檔的現象，所以離開前一定要檢查
調水浴鍋到57℃，以便做還原時不用等。
9．還原： 加入還原劑，封口，57℃水浴一小時
還原劑：25mm的nh4hco3（含10mm dtt）
參考配製方法（4ml）：6.2mgdtt溶於4ml 25mm的nh4hco3中
注意事項：1. 注意在水浴鍋上寫紙條標明使用者名字，水溫和使用的時間段，方便實驗之間的協調和發生停電等意外情況時別的同學幫助臨時處理樣品。
2．水浴鍋用完後恢復到還原前的初始狀態，以免後來的同學做實驗時因為習慣或者經驗忽略此處造成不必要的失誤。
10．烷基化：從水浴鍋取出樣品後，室溫冷卻，去掉過量的液體，迅速加入同體積的烷基化試劑室溫暗處放置30min.
烷基化試劑：25mm的nh4hco3（含55mm iaa）
參考配製方法（4ml）：40.69mg iaa溶於4ml 25mm的nh4hco3中
注意事項: 1、樣品多的時候，可以將先加了烷基化試劑的樣品先放入暗處，並記住放入順序和時間，以便取出時按時間順序處理。
2、注意實驗時暗處的衛生情況，應該放在乾淨處，且建議在取出後先用酒精把樣品盒擦拭後再做後續實驗。
11．終止烷基化反應，洗掉iaa
用25mm的nh4hco3洗膠塊兩次
12．脫水：同步驟5
13．吸脹：加入25mm的nh4hco3，**，靜置5分鐘，吸出。
14．脫水：同步驟5
15．凍乾：用封口膜封口，扎孔，凍乾30分鐘，注意該步要完全凍乾。
16．加酶：每管加入適量的酶液（切膠儀切的膠塊每管加4ul酶液），冰上放置
30min
酶液的配製：將12m hcl稀釋到1mm hcl,
稀釋過程：12m 6m 1m 200mm 1mm
取20ul 1mm hcl加入酶中，得1ug/ul的原液,按2ul每管分裝
每2ul酶液用98ul覆蓋液（10%乙腈，25mm的nh4hco3）稀釋到
0.02ug/ul
參考覆蓋液配製（2ml）100mm nh4hco3 500ul
100%乙腈 200 ul
雙蒸水1.3ml
注意事項：酶從冰箱取出後所有操作過程，包括樣品加酶後，都要放到冰上。
17．檢查酶液吸脹情況，多餘的酶液吸走，酶液不夠，即膠塊中仍有白色，則加
入適量酶液。
18．加覆蓋液20ul封口，37℃保溫16-18小時。
三. 蛋白質酶解後樣品的提取
7. 將樣品從37度水浴鍋中取出後，10000 g/1 min.
8. 將上清轉移到洗乾淨的ep管中。
9. 在剩餘膠塊中加入萃取液（2.5 % tfa ,67% acn for maldi ,5% formic acid 67% acn for esi）,37%保溫30min。
10. 超聲15min，間隔5min重複超聲 15 min 。水溫不超過40度。
11. 10000 g/1min，合併上清。
12. 冷凍離心乾燥至2-5 ul供質譜檢測。
酶解崗位職責
1 遵守紀律 堅守崗位 服從安排 積極學習掌握酶解相關知識。提高裝置操作技能，按時保質保量完成生產任務。2 嚴格進行酶解罐，相關廣利的消毒以及周邊場所的衛生清潔工作。3 按工藝流程要求。準確掌握加水墨以及原料，酶的種類 數量 投入時間 投入溫度，做到準確無誤。4 嚴格控制好酶解所需的時間 溫度。5 ...
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高考考綱要求理解酶的概念和酶的特性，同時考察曲線分析和實驗設計能力。以圖表形式考察酶的特性及以酶的實驗為背景考察實驗 能力是高考命題的熱點。在一輪複習的過程中，引導學生運用所學知識做好相關實驗題是這一部分的乙個難點。實驗題的型別大體分二類 驗證性實驗和 性實驗。下面就兩類實驗的解題思路談一下自己的見...
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