————蔗糖酶公尺氏常數的測
【目的要求】
1．了解酶促動力學研究的範圍。
2．以蔗糖酶為例，掌握測定公尺氏常數(km)
【實驗原理】
在酶促反應中，當反應體系的溫度、ph和酶濃度恆定時，反應初速度(v)則隨底物
濃度[s]的增加而加速，最後達到極限，稱為最大反應速度(v)。michaelis和menten
根據反應速度與底物濃度的這種關係，推導出如下方程：
[+[s]}', 'altimg': '', 'w': '100', 'h': '46'}]
此式稱為公尺氏方程，式中km稱為公尺氏常數，按此方程，可用作圖法求出km。方法有：
1．以v[s]作圖
由公尺氏方程可知，v=v／2時，km＝[s]即公尺氏常數值等於反應速度達到最大反應速度一半時所需底物濃度。因此，可測定一系列不同底物濃度的反應速度v,以v對[s]作圖。當v＝v／2時，其相應底物濃度即為km。
2．以1／v對1／[s]作圖
取公尺氏方程的倒數式
[=\\frac}\\frac+\\frac', 'altimg': '', 'w': '134', 'h': '46'}]
以1／v對1／[s]作圖可得一直線，其斜率為km／v，截距為1/v。若將直線延長與橫軸相交，則該交點在數值上等於—l／km。
本實驗以蔗糖為底物．利用一定量蔗糖酶水解不同濃度蔗糖所形成的產物(葡萄糖和果糖)的量來計算蔗糖酶的km值。葡萄糖和果糖能與3，5—二硝基水楊酸試劑反應，生成桔紅色化合物，可於520nm處比色測定之。
【試驗材料】
1．試劑
(1)標準葡萄糖溶液：準確稱取100mg葡萄糖溶於少量飽和的苯甲酸溶液(0.3%)，再轉移到100ml容量瓶中，用飽和苯甲酸溶液稀釋到刻度，混勻，即得濃度為1mg／m1的標準葡萄糖溶液。
冰箱貯藏可長期儲存；
(2)ph4.5的0.1mol/l醋酸緩衝液：取lmol/l醋酸鈉溶液43m1及lmol／l醋酸溶液57m1，稀釋至1000m1即得；
(3)ph4.5的10％蔗糖溶液：準確取l0g蔗糖溶於少量ph4.5的0.1mol／l醋酸緩衝液，轉移到100ml容量瓶中，用同樣緩衝液稀釋到刻度備用；
(4)3，5—二硝基水楊酸試劑：溶液i：4.5％naoh溶液300m1，1％3，5一二硝基水楊酸溶液880m1及酒石酸鉀鈉(knac4o6·4h20)255g三者一起混合均勻。
溶液ⅱ：取結晶酚10g及lo％naoh溶液22m1，加蒸餾水稀釋成100ml，混勻。
溶液ⅲ：取6.9gnahso3溶於64ml溶液n中。
將溶液皿和溶液i混合，激烈振搖混勻，即得3，5—二硝基水楊酸溶液，放置一周後備用。
(5)酵母蔗糖酶溶液：稱取鮮酵母l0g於研缽中，加少量細砂及10一15ml蒸餾水研磨。磨細後置冰箱中，過濾，濾液加2—3倍體積冷丙酮，攪拌均勻後離心，沉澱用丙酮洗兩次，真空乾燥得固體粉末狀酶，再溶於100ml蒸餾水，即得酶溶液。
若有不溶物可用離心法除去。
該酶液活力以6—12單位為佳。蔗糖酶活力單位的定義為：在一定條件下反應5min，每產生lmg葡萄糖所需要的酶量。備用。
2．器材
(1)100m1三角燒瓶2只；
(2)研缽1只；
(3)50m1及100m1容量瓶各1只；
(4)離心機1臺(4000rpm)；
(5)糖管8支；
(6)恆溫水浴1臺；
(7)吸量管：1.0ml×2支；
(8)秒錶1只；
(9)72l型分光光度計1臺。
【實驗方法】
1．標準曲線的繪製
取乾淨糖管6支，如下表所示新增試劑。
加畢混勻．於沸水中準確煮5min，取出用自來水冷卻3min，稀釋至25ml，混勻後以零號管調零點，於520nm處測定吸光度。以葡萄糖含量為橫座標，以吸光度為縱座標作圖。
2．根據活力選擇酶濃度
將10％蔗糖溶液稀釋成ph4.5的6.5％的溶液，取此溶液5m1於試管中，共加兩管。
將兩管同時置於25℃水浴中保溫5min，然後向管中加入蔗糖酶溶液1.0ml，立即混勻，
同時用秒錶計時，準確反應5min後，立即加入5ml0.1mol/lnaoh溶液終止酶反應。另
一管先加入5.0ml0.11mol/lnaoh溶液，再加入蔗糖酶溶液1.0ml(此為對照管)。
取乾淨糖管3支，第l、2管分別加入上述反應液各1.0ml及水各1.0m1，第3管加蒸餾水2.
0ml，然後各管均加3.0ml二硝基水楊酸溶液。置沸水浴中煮5min，取出後經自來水冷卻3min，加水至25m1，混勻，以第3管調零點，於520nm處測吸光度值。
以測定管的吸光度值減去對照管吸光度值，求得的差值從標準曲線上查得相應的葡萄糖含量，並乘以ll，即為每1ml酶溶液的活力。
測定管中因酶催化水解而產生的葡萄糖含量以在0.4—1.6mg之間為佳，過高或過低均應適當改變蔗糖酶溶液的濃度或反應液用量後再測。
3．底物濃度對酶促反應速度的影響——公尺氏常數購測定
取試管7支，按下錶所示加入試劑。
當加完蔗糖溶液及ph4.5醋酸緩衝液後，均放置室溫或恆溫水浴(20℃或25℃)保
溫5min，再分別依次向各管加入蔗糖酶溶液1.0ml，立即搖勻．記錄時間。準確反應
5min，再準時加入0.1mol/l的naoh溶液，立即搖勻，以終止反應。
測定管反應完成後，取8支潔淨糖管，前7支分別加入相應的上述反應液各1.0ml及
蒸餾水各1.0ml，第8支糖管加入2.0ml蒸餾水作空白，然後各管均加入3.0ml二硝基水
楊酸溶液，沸水浴5min。取出用自來水冷卻3min，稀釋到25m1，混勻，於520nm處比色
測定並記錄吸光度值。
對照管的測定與測定管的操作相同。
【結果處理】
根據各測定管的吸光度值(需減去相應對照管的吸光度值)，從標準曲線上查出相應的還原糖毫克數(以在0．4一1．6mg範圍內為佳，否則應調整反應液用量後重新測定)，再乘以11，即得各管的產物量，然後分別計算各反應管相應的[s]、l／[s]、v及1/v，並作出v—[s]及1/v—1／[s]曲線。再根據所作的兩種動力學曲線，分別求出酵母蔗糖酶的km值，並加以比較。
上述資料可記錄在下表中。
酵母蔗糖酶的提取
實驗原理：
蔗糖酶主要存在於酵母中，但工業上通常從酵母中製取。酵母蔗糖酶系胞內酶，提取時細胞破碎或菌體自溶。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉澱、離子交換和凝膠柱層析。
以此可得到較高純度的酶。
細胞破壁的幾種方法
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。
2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研杆來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。
3、反覆凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反覆幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
4、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇**破裂，此法多適用於微生物材料。
5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（sds）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。
有機溶劑沉澱法即向水溶液中加入一定量的親水性的有機溶劑可降低溶質的溶解度使其沉澱被析出。
三、試劑：
啤酒酵母 、 二氧化矽 、甲苯（使用前預冷到0℃以下）、去離子水（使用前冷至4℃左右）、1mol / l 醋酸 、95%乙醇
四、儀器：
研缽1個、離心管3個 、 3. 滴管3個、量筒50ml 1個、水浴鍋1個、恆溫水浴、燒杯100ml 2個、廣泛ph試紙、高速冷凍離心機
四、操作步驟：
1. 提取
（1）準備乙個冰浴，將研缽穩妥放入冰浴中。預先在冰箱中冷卻20g幹酵
母和10g二氧化矽。
（2）將20g幹酵母粉和10g二氧化矽，放入研缽中。量取預冷的甲苯30ml緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成糊狀，約需60分鐘。研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細胞大部分研碎。
（3）緩慢加入預冷的40ml去離子水，每次加2ml左右，邊加邊研磨，至少用30分鐘。以便將蔗糖酶充分轉入水相。
（4）將混合物轉入兩個離心管中，平衡後，用高速冷離心機離心，4℃，10000rpm，10min。如果中間白色的脂肪層厚，說明研磨效果良好。用滴管吸出上層有機相。
（5）用滴管小心地取出脂肪層下面的水相，轉入另乙個清潔的離心管中，4℃，10000rpm，離心10min。
（6）將清液轉入量筒，量出體積，留出1.5ml測定酶活力及蛋白含量。剩餘部分轉入清潔離心管中。
（7）用ph試紙檢查清液ph，用1mol / l 醋酸將ph調至5.0，稱為「粗級分i」。
蔗糖轉化反應動力學實驗報告
姓名 學號 班級 1 實驗目的 1 測定蔗糖水溶液在酸催化作用下的反應速率常數和半衰期。2 了解旋光度的概念，學習旋光度的測量方法及在化學反應動力學研究中的應用。2 原理 蔗糖在水溶液中的轉化反應為 此反應是乙個二級反應，在純水中反應速率極慢，通常需要在h 的催化作用下進行。當蔗糖含量不大時，反應過...
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試卷號 pb060032 一 本大題15分 圖示體系 不計杆質量 試求其自振頻率 二 本大題15分 求圖示體系支座彎矩的最大值 荷載 三 本大題20分 求圖示體系的自振頻率和主振型 並作出振型圖 已知 ei 常數 四 本大題20分 試作圖示體系的動力彎矩圖。柱高均為，柱剛度常數 五 本大題30分 求...