活性電泳(明膠酶譜法)
一、實驗原理
明膠酶譜法的基本過程是先將樣品進行非還原性sds-page（含0.1%明膠）電泳分離，然後在緩衝系統中使樣品中的酶恢復活性，在各自的遷移位置水解凝膠裡的明膠，最後用考馬斯亮藍將凝膠染色，再脫色，在藍色背景下可出現白色條帶，條帶的強弱與酶的量和比活成正比。
復性原理：在電泳過程中，sds與樣品中的酶結合（可逆性結合），破壞其氫鍵、疏水鍵而使酶不能發揮其分解明膠的作用，而只有當將膠置triton中**洗脫時，由於sds被triton結合而去除，從而使酶恢復了活性，此步注意上樣緩衝液中不能含有dtt等還原性物質。
通過不同孔徑凝膠電泳達到分離蛋白的目的，而活性電泳又能保證蛋白的活性，在孵育條件下，酶對明膠的水解使後期染色出現白色條帶，得以定位目的酶。通過對該位置酶的**與質譜鑑定，得到該酶部分氨基酸序列。
二、材料與方法
1試劑與溶液配製
1.1試劑和儀器：
酪氨酸，酪蛋白，明膠（豬源），tris，glycine，temed，sds，過硫酸銨，考馬斯亮藍r250購自sigma公司，為電泳純；triton x-100，cacl2·2h2o，brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），nacl，乙酸，乙酸鈉，碳酸鈉，甲醇，乙酸，鹽酸，三氯乙酸，福林試劑均為國產分析純；30%丙烯醯胺溶液（29:1），非還原性5×蛋白上樣緩衝液，預染彩虹蛋白marker等購自康為世紀公司。水為去離子水或超純水。
主要儀器：紫外分光光度計電泳儀垂直電泳槽高速離心機 milipore超濾管等
1.2溶液配製
1.2.1 5×sds-page電泳緩衝液
配法：稱取tris 15.1g，glycine 94g，加適量去離子水溶解，加入sds 5.
0g，加水至約800ml，注意儘量減少氣泡生成，完全溶解後定容至1000ml，室溫儲存。使用時用去離子水稀釋至1×，新配置的電泳液可重複使用1-2次，最好使用新鮮配製的電泳液。
1.2.2 明膠儲液（10 mg/ml）
配法：稱取明膠0.1 g，加去離子水10 ml，溶解，配好後儲存於4℃。若凝固成膠凍狀可用溫水浴解凍。
1.2.3 10 %過硫酸銨（w/v）
配法：稱取1g過硫酸銨；加入10ml的去離子水，將固體粉末徹底溶解；貯存於4℃。注意：
10%過硫酸銨最好現配現用，配好的溶液在4℃儲存可使用2周左右，過期會凝膠效果會減弱，可適當增加用量。
1.2.4凝膠配製：
1) 10% sds-page凝膠之分離膠（含1.0 mg/ml明膠）
2) 5%濃縮膠的配置
3) 配製梯度膠的丙烯醯胺凝膠輕溶液（5%）
4) 配製梯度膠的丙烯醯胺凝膠重溶液
重溶液新增蔗糖至0.1g/ml，增加溶液密度。
1.2.5洗脫液（1×）
配法：量取triton x-100 25 ml，加去離子水定容至1000 ml即可。
1.2.6孵育液（1×）
配法：1)中性孵育液：稱取tris鹼6.
06 g，cacl2·2h2o 0.74 g（或cacl20.555 g），brij-35 0.
2 g，nacl11.7 g；加水至800 ml；用濃hcl調ph至7.6；定容至1000 ml。
2)弱酸性孵育液 40g nach3cooh·3h2o溶於適量水，6mol ch3cooh 168ml，cacl2·2h2o 0.74 g（或cacl20.555 g），brij-35 0.
2 g，nacl11.7 g，加水至800，用冰乙酸調ph至4.0，定容，1000ml。
1.2.70.5%（w/v）考馬斯亮藍r-250(400 ml)
配法：稱取2 g考馬斯亮藍r-250，置於1 l燒杯中；量取100 ml異丙醇加入上述燒杯中，攪拌溶解；加入40 ml冰醋酸，攪拌均勻；加入260 ml去離子水，攪拌溶解；用濾紙過濾除去顆粒物質後，室溫儲存。
1.2.8考馬斯亮藍脫色液（400ml）
配法：甲醇：乙酸：水=5：1：4。
2 實驗方法
2.1蛋白酶樣品製備
樣品液前處理：發酵液10000g 離心，上清液經3kd超濾管6500 rpm濃縮，得到粗酶液，﹣20℃儲存。
2.2 樣品液蛋白酶活性的測定（福林一酚試劑法）
2.2.1 標準曲線的製作：
精確稱取烘乾的酪氨酸50mg，加少量0.2 mol/l鹽酸溶解，用50mmol/l的tris-hcl (ph9.0) 緩衝液定容至100 ml，分別配成0-100 μgm/l的不同濃度的溶液。
不同濃度酪氨酸溶液各取lml，加2%酪素l ml，於50℃水浴中反應15分鐘，然後加入10%三氯乙酸(tca) 2 ml，離心，取上清液l ml，加入0.4mol/l的碳酸鈉5 ml，再加入福林試劑l ml，於37℃水浴中顯色15分鐘，在680 nm波長比色，測光密度 (以光密度讀數為縱座標，酪氨酸的微克數為橫座標，繪製標準曲線。
2.2.2 樣品測定：取適當稀釋的酶液l ml，加入2%酪素l ml，以下操作同上，同時作對照管。
2.2.3 酶活定義：在50℃，ph9.0的條件下每分鐘水解酪蛋白產生l μg酪氨酸的酶量定義為乙個酶活力單位(u)。
樣品中含蛋白酶活力單位=a×f/15。
式中：a為由樣品測定的光密度值查曲線得到的相當於酪氨酸的微克數，f為酶液最終稀釋倍數，15為反應時間(分鐘)。
2.2.4 調整樣品液的濃度，計算出凝膠電泳所需酶量（約200u），若樣品液比活不夠高，須進一步濃縮以提高樣品比活，或適當提高加樣量。
2.3 活性膠操作步驟（gelatin zymogram）
2.3.1配膠
梯度膠配製：灌製梯度膠與線性膠最大的區別在於需要使用梯度生成裝置。高濃度丙烯醯胺溶液內加入蔗糖可以穩定梯度的形成。
操作步驟：
1） 準備好凝膠模具，並裝配好梯度混合器，下置磁力攪拌器，混合槽內放入小轉子，調整流速約為5ml/min(可使用蠕動幫浦)。
2）準備好未加temed的輕重分離膠溶液，灌製1mm厚的小板膠約需要輕重溶液各4ml，灌製1mm厚的大板膠約需要輕重溶液各15-18ml，倒入混合器前加入temed並混勻。
3）關閉梯度混合器的輸出閥和兩液槽間的連通閥，在貯液槽中加入定量的凝膠輕溶液，短暫開啟連通閥，讓少量輕溶液通過閥門流入混合槽中以除去閥門內氣泡，防止堵塞。
4）在混合槽中加入等量凝膠重溶液，完全開啟連通閥，開啟磁力攪拌器，調整轉速至混合槽內液體稍起漩渦，並固定轉速，制相同凝膠使用固定轉速以保證制膠的重複性。
5）開啟連通閥，輸出管頭從膠板夾層頂部加入凝膠液體，吸頭對著夾層一面，使液體只沿一塊玻璃板留下。當最後輕溶液流入輸出管時，要注意，調整流速，確保最後幾毫公升輕溶液不致過快流入凝膠夾層影響梯度形成。
6）梯度膠頂部用1ml槍緩慢加入少量水，讓凝膠聚合約1h充分聚合。
7）灌製濃縮膠，準備樣品，加樣進行電泳。
注意：一次可同時跑兩板膠，配膠時一板為新增明膠的活性膠，一板為無明膠的普通膠，配膠過程盡量一致，普通膠做對照。
2.3.2上樣，樣品與非還原性上樣緩衝液混合，室溫靜置10 min，不能加熱。
2.3.3 同常規電泳，電泳槽冰浴，電壓100-200 v，標記跑至距凝膠底部1-2cm時結束。
2.4活性膠的處理
2.4.1 直接酶譜法
1) 活性膠孵育最適ph
製備活性膠a 2板（含明膠），濃度梯度為5%-20%，電泳結束後，洗脫，漂洗；漂洗完畢後，凝膠置於不同ph的孵育液中50℃孵育3h；考馬斯亮藍r-250 染色1h，脫色液脫色過夜。
2） 活性膠孵育最佳時間
製備活性膠a 2板（含明膠），電泳洗脫漂洗同上，孵育時將膠條置於已確定的最適ph孵育液內，分別孵育1h、3h、6h、12h。孵育完畢後操作同上。
3） 蛋白酶電泳後位置的標定
製備活性膠a 1板，b 1板，c 1板；電泳洗脫漂洗同上；a膠於最適ph孵育液孵育最佳時間後染色脫色；b膠浸泡2%酪蛋白溶液2h，孵育同a膠，染色脫色；c膠電泳結束後，切下一條泳道，直接染色脫色，其餘不作處理，４攝氏度儲存。
根據a b膠亮帶位置，對比各蛋白酶亮帶位置；比較b亮帶位置與c膠蛋白條帶進行對比，確定ａｂ膠亮帶對應的蛋白酶在ｃ膠中的大概位置。
4）將ｃ膠中亮帶對應的位置附近幾條蛋白條帶分別切下，**。
操作見表1。
表1 活性膠的處理
孵育完畢後，染色1h，過夜脫色。
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