tetsuo machida等日本群馬大學醫學研究院臨床醫學實驗部
摘要背景脂蛋白脂肪酶（lpl）通過催化甘油三酯的水解在富含甘油三酯的脂蛋白代謝中起關鍵作用。血清脂蛋白脂肪酶的含量測定有利於脂類代謝紊亂的診斷，但目前在臨床上沒有快速測定lpl的方法。
方法使用膠乳顆粒固定化的lpl單轉殖抗體，我們探索了一種快速靈敏的膠乳增強免疫比濁法（ltia）測定lpl的方法。實驗使用生化分析儀器日立7700p進行檢測，同時進行了elisa平行實驗來評價實驗資料的可靠性。
結果通過稀釋實驗得到0.5-800ng/ml的校準曲線。批內變異係數被控制在2.
2-2.5%。含有潛在干擾物質膽紅素f和c以及血紅素、甘油三酯、類風濕因子的樣本未觀察到干擾性。
ltia與elisa的結果具有很好的相關性（n=40， r=0.967， y=0.99x-1.
86）。肝素處理前的血清lpl正常參考範圍值為50-77 ng/ml，肝素處理後血漿lpl正常參考範圍值為354-410 ng/ml。
結論本文ltia法既可用於測定肝素處理前的血清lpl值，也可用於測定肝素處理後血漿lpl值。本方法與elisa相比更為方便快捷，非常適合用於臨床常規檢查。
1前言lpl在脂類與脂蛋白的轉運和代謝中發揮關鍵性作用[1，2]，此酶負責乳糜內甘油三酯（tg）和極低密度脂蛋白(vldl)的水解，分別形成乳糜和極低密度脂蛋白的殘渣。血漿中lpl的常規檢測方法是在靜脈注射肝素後進行elisa實驗測定其活性和濃度。據報道在肝素處理前血清lpl具有比較高的濃度（大約30-100ng/ml），但lpl活性無法檢測到，表明大部分迴圈lpl沒有催化活性，只是其受體的配體[3,6]。
肝素處理後血漿lpl的濃度與活性的測定已被用於臨床lpl缺失的診斷[2]，但通常不能用於脂類代謝紊亂或心血管疾病風險性的診斷。這是因為肝素的注射使lpl從血管內皮細胞分離出來，因此檢測結果不能直接反映迴圈lpl的生理或病理濃度。
brunzell等[7]和ikeda等[8]等此前報道了運用特異性單轉殖抗體的lpl-elisa檢測人血漿lpl的方法，在檢測前需要給病人靜脈注射肝素。從檢測時間和操作步驟角度考慮，elisa法不適合在臨床實驗室進行大規模的常規檢查。
因此，仍需要一種可靠、快速的自動化檢測lpl的方法，且具有高靈敏度和校準穩定性，尤其是在肝素處理前血清lpl濃度的測定可能具有臨床參考價值的情況下。在過去數十年間shirai及其同事以lpl-elisa法檢測了肝素處理前血清lpl的濃度，揭示了肝素處理前血清lpl濃度在心血管疾病和糖尿病中的臨床意義[9-16]。
我們近期通過比對研究發現肝素處理前血清中lpl的濃度與肝素處理後的血漿中lpl的濃度可以替換[17]。肝素處理前血清中lpl濃度的測定可以使用自動分析儀檢測，不需要提前為病人注射肝素，在高甘油三酯病人的臨床診斷方面的應用更具有可操作性。由於肝素處理前血清中lpl的濃度足以用膠乳檢測系統測定，我們使用膠乳顆粒固定化的lpl單轉殖抗體，研究出了一種快速靈敏的膠乳增強免疫比濁法（ltia）測定lpl的方法。
我們所使用的全自動生化分析儀是日立7700p。我們以本方法和已商業化的elisa試劑[18]對肝素注射（或未注射的）正常志願者進行了檢測，並將兩種方法的檢測結果做了相應比較。
2材料與方法
2.1試劑
聚苯乙烯膠乳顆粒購買自日本騰倉公司，胎牛血清白蛋白購買自sigma公司。干擾性試劑血紅素、甘油三酯、類風濕因子和膽紅素f、c購買自日本希森美康公司。所有化學藥品或試劑均是最高純度級別。
2.2血液樣品製備
本研究選擇了美國戴維斯加州大學相對比較健康的年輕志願者（部分為超重或偏胖）進行檢測。男性19人，女性21人。白種人25個，亞洲人5個，西班牙人4個，非裔美國人3個，其他人員3個。
平均年齡24歲，體質指數24。這些志願者均在注射肝素（50u/kg）後進行了lpl活性檢測[19]。加州大學戴維斯評審委員會批准了實驗程式以及已簽訂書面同意書參與研究的受試者。
在日本天使大學（位於日本札幌）徵集了240個健康志願者（男性170人，女性70人。平均年齡26歲，平均體質指數21.6），他們均有書面知情同意書，得到了大學倫理委員會的批准。
製備的血清用於測定精密度、靈敏度、交叉反應、稀釋、**實驗和正常參考範圍。
2.3抗lpl抗體的製備
在免疫生物學實驗室製備了抗人類重組lpl的抗體。在小鼠腹水中取得抗lpl的單轉殖抗體後，通過蛋白g瓊脂糖（ge 醫療保健公司）分離兩種球蛋白抗體的片段（57a5和88b8），用0.1mol/l檸檬酸鹽緩衝液（ph2.
5）洗脫, 再用pbs緩衝液透析。通過檢測光密度估計抗體溶液中的蛋白濃度。
2.4膠乳顆粒固定的抗體試劑的製備
參考他人的膠乳標記免疫檢測試驗[19]對試劑進行了優化。聚苯乙烯膠乳珠子的直徑和用於固定的抗體的量作了調整。我們此前的研究證實膠乳顆粒的體積對於檢測範圍有重大影響，固定化抗體的使用量與檢測的靈敏度相關。
為適合血清中lpl的範圍，我們使用了0.3μm的膠乳顆粒。聚苯乙烯膠乳珠子（100mg，平均直接0.
2μm）懸浮在1ml 0.01mol/l hepes緩衝液（ph7.0）中。
9ml抗體溶液（0.5mg/ml）與1ml 10%（重量/體積比）聚苯乙烯膠乳珠子懸浮液撫育在0.01mol/l hepes緩衝液（ph7.
0）中37℃1小時，然後以3:2的體積比在膠乳顆粒懸浮液中加入含有0.5%bsa的0.
01mol/l的hepes緩衝液。1小時以後，洗固定了抗體的膠乳珠子兩次並離心，然後用10ml 0.01mol/l的hepes緩衝液（ph7.
0）重懸，重懸後的抗體膠乳珠子放在4℃儲存。
2.5校準品的製備
用於室內lpl測定的校準品是在免疫生物學實驗室（日本滕岡市）用倉鼠細胞（cho）產生的重組lpl，溶解在tris-hcl緩衝液（ph8.0）中。為了評價我們的校準品，從積水醫療公司購買具有已知濃度的校準品作為對照。
2.6檢測程式
樣品的加樣與檢測均由自動生化分析儀日立7700p（日立儀器工程公司）全自動完成。檢測程式很簡單，4μl血清樣品和160μl試劑1（0.01mol/l hepes緩衝液, ph7.
0）首先加入到比色皿中，37℃撫育5min，然後加入54μl試劑2（抗體固定化的膠乳珠子懸浮在0.01 mol/l hepes緩衝液, ph7.0），啟動免疫比濁反應。
5min後，根據在800nm主波長兩個讀數點（加入試劑2前、加入試劑2反應5min）之間的吸光度變化計算出lpl的濃度。通過對6個校準品的反應檢測獲得了校準曲線並以此來計算血清中lpl的濃度。使用lpl-elisa試劑盒（積水醫療，東京）做了elisa檢測。
2.7統計學分析
所有分析均由dr. spss ii軟體包（spss公司）完成。提供的資料是平均值、25%和75%的值，而不是平均值和標準差。
因為lpl的濃度不是正常分布的。計算了ltia和elisa之間的皮爾森相關係數。計算了lpl與甘油三酯(tg)、高密度膽固醇(hdl-c)、低密度膽固醇(ldl-c)、脂蛋白殘粒膽固醇（rlp-c）、小而密低密度脂蛋白膽固醇(sd ldl-c)和載脂蛋白c iii之間的單變數分析。
lpl與上述脂類引數的相關性通過斯皮爾曼（spearman）相關係數進行評價。p＜0.05認為具有統計學顯著意義。
圖1. ltia的線性。在生化分析儀日立7700p上檢測了lpl的線性。肝素處理前的血清（圖1a）和肝素處理後血漿（圖1b）lpl濃度的檢測分別各用了一組校準品。
3.結果
3.1線性
以6個濃度梯度的重組lpl（0, 50, 100, 200, 400和800ng/ml）來擬合校準曲線。用生理鹽水稀釋（最高達10倍）樣本，每個稀釋樣本重複檢測三次，評價其線性。檢測範圍在0-200ng/ml和0-800ng/ml，與理論值的偏差未超過5%，說明平行性和線性良好（圖1a和b）。
結果表明在低值（150 ng/ml）和高值（800ng/ml）範圍均有比較好的線性。
表1批內精密度（對低值、中值和高值分別分析）
3.2精密度
為了評價ltia的精密度，我們進行了重複實驗（表1）。收集的3組血漿等分到1.5ml的塑料管中-70℃冷凍儲存。
校準後在一天內分析了三個樣品10次。如表1所示，32ng/ml的批內變異係數是5.5%，100 ng/ml的批內變異係數是2.
4%，280 ng/ml的批內變異係數是2.2%。
圖2.以零校準加2.6 10次重複檢測值的平均吸光度來估計檢測限度（lpl concentration:
lpl濃度； dilution： 稀釋梯度； theoretical value：理論值; **erage:
平均值）
3.3低值檢測限度
圖2顯示，濃度估計值與10個重複結果的平均值基本一致。本檢測的最低限度是10.7ng/ml。
3.4汙染
我們在檢測較高濃度的樣本（400ng/ml）後檢測生理鹽水，在日立7700p未發現可檢測到的lpl汙染。
3.5血漿中lpl的穩定性
新鮮的樣本與4℃儲存2天的樣本或反覆凍融的樣本之間不存在顯著差異，表明lpl具有很好的穩定性（詳情未提供）。這些檢測結果與elisa法[18]的檢測結果一致。
3.6干擾性
通過在血清樣本中加入可能的干擾性物質並檢測吸光度的變化來評價抗干擾能力（圖3）。我們研究了血紅蛋白、甘油三酯（tg）、類風濕因子()和游離膽紅素f、c對於lpl檢測的影響。高達200mg/l膽紅素f、c未影響檢測準確度。
5g/l的血紅蛋白、1500ftu的甘油三酯和500iu/ml的類風濕因子也未影響檢測準確度。lpl**實驗偏差是初始濃度的10%以內（資料未提供）。結果表明所新增的這些干擾性物質未對lpl的準確檢測造成干擾。
圖3. 干擾性測試。（unconjugated bilirubin非結合膽紅素；conjugated bilirubin結合膽紅素；turbidity濁度；hemoglobin血紅素；rheumatoid factor類風濕因子 ）。
3.7 ltia與elisa的相關性
為了對比litia與elisa的結果，對肝素處理前的血清和肝素處理後的血漿都用兩個不同範圍的校準品進行了分析。如圖4a所示，回歸統計計算方程（n=40）為y（ltia）=0.845x(elisa)+4.
433，r =0.965。如圖4b所示，即使在相對比較高值的血漿中，lpl值在0-600ng/ml(n=40),相關性回歸方程為y（ltia）=0.
871x(elisa)+10.114，r =0.942。
說明ltia與elisa兩種檢測方法的相關性良好。我們繪製了bland-altman圖來展示兩種檢測方法的差異[21]。差異圖表顯示用ltia和elisa檢測的結果是有差異的，兩種方法95%的置信界限分別是±13ng/ml和±31ng/ml。
兩種免疫檢測法的平均差分別是6.8ng/ml和45ng/ml，表明兩種方法沒有連續性偏倚。lpl濃度高於300ng/ml時，變異係數有一定程度的增大，這並不被認為會降低本方法的可靠性或潛在用途，因為風險評估主要面向低值範圍。
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