一、 測 o2法
漆酶是一種多酚氧化酶，它所催化的反應過程中有o z 的介入。測量反應的耗氧量既可間接地推知漆酶的活性。較早建立的瓦氏呼吸器檢測法便是基於這一原理。
這一方法後來改進為利用氧電極來測量耗氧量，如弗羅納等以愈創木酚為底物，利用氧電極測定了漆酶催化反應過程中的耗氧量，並將 1個漆酶活性單位定義為ph6 ． o 及2 5 ℃條件下以愈刨木酚作為電子供體時消耗1. 0 μmo lo2所需要的酶量。亦可取醌醇作底物．利用氧電極測定漆酶的活性。
郭明高提出了測定生漆漆酶活性的吸氧法。即將生漆溶於甲苯，測定酶促吸氧速度和累計酶促吸氧量， 同時利用鹼促吸氧法測定反應前後漆酚濃度的變化，從而可以求得漆酚濃度衰減的規律及漆酶促吸氧的克分子比。此法的特點是反應時漆酶處於其天然存l 在的狀態而反應底物又恰為漆酶的天然底物漆酚，這在漆酶測活研究中尚屬首倒 [ 2 1 。
漆樹酶活力檢測
用0..1mol·l-1磷酸鹽緩衝液與有機溶劑配成一定體積的底物，其濃度為1．35×10 mol·l-1。分別移取3ml於1cm測量池和參比池中，恆溫水浴中預熱 10min．注入20μl漆樹酶溶液(含酶2～3 μg)於測量池中，立即攪勻，測定350nm處吸光度a隨時間的變化值．漆酶比活力定義為一定溫度下,單位酶量催化反應的初速度，單位記為△a350mm(mg·min-1)．將漆樹酶在不同溶劑體系中的比活力與漆樹酶在純水體系中的比活力相比，其比值稱活力比()
212 漆酶活性的定量測定方法
21211 分光光度計法測定漆酶活性
對苯二胺(λmax495) 、愈創木酚(λmax 485) 、鄰苯二酚(λmax 400)和漆酚(λmax 420)都可用做漆酶活力測定的底物。不同**(植物、細菌、昆蟲、真菌)的漆酶與底物反應的親和力不同 ,酶活性測定方法中所用的反應底物、反應條件以及酶活性單位定義對漆酶活性的測定結果有很大的影響。肖亞中等分別以 2 ,2′ 2連氮二(32乙基苯並噻唑262磺酸 ,簡稱abts) 、丁香醛連氮愈創木酚和鄰聯甲苯胺為底物 ,採用分光光度法測定蜜環菌( armillaria mellea)胞外漆酶的活力 ,比較了這種底物對漆酶的敏感性 ,結果表明對於同一底物 ,反應時間、溫度、緩衝液種類及其 ph值和酶的用量等條件對漆酶催化反應都有不同程度的影響。
鄰聯甲苯胺水溶性較差;愈創木酚為底物時反應非常穩定 ,但反應時間長、測得的漆酶活性值偏低 ,已較少採用;以丁香醛連氮為底物時 ,漆酶活性值雖然較高 ,但當底物和酶液用量較大時反應不穩定 ,若採取減少底物和酶液用量的方法 ,可較大程度地克服反應不易終止的缺陷。目前常以 abts 為底物 ,測定漆酶活性 ,反應穩定、重現性好。21212 通過檢測酶與底物中間體來測定漆酶活性在酶反應開始時產物生成量很少,而酶2底物中間體生成的速率較快。
若採用初始速率法測定中間體的濃度 ,可間接測定漆酶活性 ,大大提高方法靈敏度。用微量熱法測定漆酶的活性 ,樣品用量少 ,並且對酶的懸浮液體也能測定 ,適宜研究酶促反應.
黃應平等利用反相膠束介質中漆酶氧化鄰苯二胺(opda反應中間體動態吸收光譜來測定漆酶活性。該方法由於在反相膠束介質中採用初始速率法進行測定 ,具有較高的靈敏度和選擇性。
已報道的定量測定漆酶活性的方法還有 hplc法、測氧法等。測氧法靈敏度低,操作繁瑣;hplc法靈敏度高,但儀器昂貴;酶催化光譜分析法應用較普遍,但一般是在水相中測定產物光譜訊號變化,靈敏度較低。
2 漆酶的酶活測定方法
測定漆酶活性的方法有hplc 法、測壓法、分光光度法、級譜法等。目前常以3-乙基苯並噻唑-6-磺酸(abts)為底物, 測定酶對其的氧化速度。 具體方法為:
反應在 25 ℃下進行, 在總反應體積 3 ml 中, 含有 2 ml 溶有 0.5 mmo labts 的 0.1 mmo ll 醋酸緩衝液(ph = 5.
0) , 新增酶液啟動反應, 在 420 nm 下測定其吸光值的變化。酶的活力單位定義為在上述條件下(25 ℃, ph5. 0) 1 ml 酶液每分鐘氧化底物(abts)引起吸光值的增加量(△od420/(ml·m in) ).
clemm ar j d 等以二茂鐵(fc ·h )作為底物, 在二乙二醇單丁醚(dgbe)磷酸緩衝液中, 用分光光度計在617 nm 處測定漆酶的活性 1 該法無副產物干擾, 重複性好。望天志等採用微量熱法測定了漆酶的活性 1。對l kb-2107batch 型微量熱系統, 在溫度為298.
15 k, ph 為 7.4 的條件下, 測定了漆酶的催化活性。該法的特點是用樣品量少, 並且對酶的懸浮液體也能測定, 宜用於研究酶促反應。
1.4 分析方法：測定漆酶酶活方法
測定漆酶酶活有以下5種方法，我們選用第一種方法來測定酶活。
1.4.1 abts ——分光光度計法
以abts 為底物測定漆酶酶活是目前國外最為常見的方法之一。它有如下優點： (1) abts 易溶於水，在室溫下放置6 個月仍較穩定。
(2) 其反應只有一步，即從abts 到它的陽離子自由基。abts 的陽離子自由基在水溶液中呈淺藍綠色，且比較穩定，通常在幾個小時或幾天之內是穩定的。 (3) 在漆酶的作用下，abts 有色溶液的摩爾吸光係數較高，說明以其為底物測定的靈敏度較高。
(4) 到目前為止，還未有報道稱abts 有致癌作用、誘變作用或是強烈的毒性。
wolfenden and wilson 分別對5 mmol/ l abts加入20μmol/ l 的抗壞血酸鹽的測定溶液，於不同波長進行了光譜掃瞄，發現純abts 呈淺藍綠色，且在415 nm 處有吸收峰；而加了抗壞血酸鹽的溶液為無色，在415 nm 處無吸收峰。 abts 的最大吸收峰在340 nm ，abts 的陽離子自由基的最大吸收峰在415 nm. 由此推斷，在abts 的溶液中含有極少的abts 陽離子自由基，它們在更強的還原劑作用下被還原為abts。
以abts 為底物進行漆酶的定量分析，通常在420 nm 下測定3 min 內吸光度的變化。用這種底物進行定量分析有乙個缺點，即abts 陽離子自由基溶液的吸光度受溶液中未反應的abts 濃度的影響。 這就產生了乙個問題：
420 nm 下的摩爾吸光係數36 000 l/ (molcm) 是在純abts 陽離子自由基的條件下求得的，而在實際測定反應中，abts 是過量的，這就導致人們低估了酶活。 這種影響不能忽視，因為反應終止時，溶液中至少還要有1 mmol/ l的abts。儘管用abts 為底物存在上述問題，但是它仍是漆酶酶活測定的最佳底物之一。
一般以abts 為底物，採用glycine2hcl 緩衝體系、乙酸2乙酸鈉緩衝體系或檸檬酸鹽2磷酸鹽緩衝體系。如果菌種產生過氧化氫，為了準確測定，需加入一定量的過氧化氫酶，用以破壞過氧化氫。因為在代謝過程中，菌體自身產生過氧化氫可激發木質素過氧化物酶與錳過氧化物酶對abts 的氧化。
1.4.2 丁香醛連氮——分光光度計法
丁香醛連氮( syringaladazine)也是漆酶酶活測定較為常見的底物之一。以丁香醛連氮為底物是將其氧化為相應的醌，它的摩爾吸光係數為65 000 l/ (molcm)。其摩爾吸光係數較大，可見用它定性測定漆酶的酶活具有較高的靈敏度。
採用mcilvaine 緩衝體系(ph = 5. 0) ，在525 nm 處測定吸光度的增加。
1.4.3 二茂鐵——分光光度計法
以二茂鐵(fe2h)為底物的反應方程式：fe2h + e2cu2 + e2cu + + [ fe2h] +e2cu + + 4h+ + o2＝e2cu2 + + 2h2o -[ fe2h] 溶於水，呈藍色，在617 nm 處出現特徵吸收峰，fe2h 不對其發生干擾。因此，以二茂鐵為底物，用分光光度法測定漆酶活性準確度較高，重複性較好。
由於二茂鐵不溶於水，因此季立才等選親水性和疏水性都較好的dgbe 作溶劑，與0. 1mol/ l 磷酸鹽緩衝液以1∶5 體積比混合後，使二茂鐵以一定濃度溶解，同時保持漆酶活性。季立才等從生漆中分離、純化漆樹漆酶，並經cm2sephadex c50 柱層析，得藍色酶液ⅰ、ⅱ、ⅲ 3個組分，以二茂鐵為底物，用dgbe2磷酸鹽緩衝液(ph = 8.
0) ，在617 nm 處測定吸光度的增加。該方法無副產物干擾，簡便、準確、易行。但目前使用並不廣泛，故用這種方法測定的酶活力的可比性不高。.
還有其它一些用於漆酶酶活測定的底物，無論用哪一種底物進行測定，都有其自身的優勢和不足。
1.4.4 微量熱法
望天志採用l kb22107 batch 型微量熱系統，在溫度為298. 15k，ph = 7. 4 的條件下，測定了漆酶催化氧化底物3 ，4 ，5-三羥基苯甲酸、鄰苯三酚、鄰甲氧基酚的活性，用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配製成ph = 7.
4 的緩衝液。 該法操作簡單，所用樣品量少，不需要光學透明的樣品，對酶的懸浮液也能直接測定，對反應體系沒有任何限制或干擾。
1.4.5 脈衝雷射光聲法
閻巨集濤等首次採用脈衝雷射光聲法測定了漆酶酶活。試驗了入射雷射能量、雷射照射時間和溫度變化等因素對漆酶活性的影響；建立了測定漆酶的光聲分析方法，檢測限為3μg ，是一種高靈敏度的生物樣品分析方法。
3.3.1 abts法測酶活
3.3.1.1 主要試劑與儀器
主要試劑：
⑴ 1 mmol/ l abts溶液，abts 為美國sig2ma 公司產品，精確稱取 0. 0274g ab ts ，用蒸餾水定容至100 ml ，置於棕色瓶備用；
⑵ hac-naac（ph4.5）緩衝溶液，18gnaac，9.8mlhac，用蒸餾水定容至1l，用ph計校準其 p h值。
主要儀器：⑴uv - 2100 型紫外 - 可見分光光度計， unico 尤尼柯（上海）儀器****；⑵delta 320型 ph計，mettler toledo 梅特勒－托利多儀器（上海）****。
3.3.1.2 漆酶最適 p h 值的測定方法
在 25 ℃時，以 2mlbritton2robinson 緩衝溶液，外加 1 ml 用蒸餾水稀釋 104 倍的漆酶液為空白；先設定引數，使吸光度自動歸零。取 1 ml 相應 ph 值的britton2robinson 緩衝溶液，用蒸餾水 1 ml 稀釋104 倍的漆酶液，再加 1 ml 的 1 mmol/ l ab ts 溶液於比色皿啟動反應，同時用 uv - 2201 型紫外 - 可見分光光度計的 time2course 程式記錄吸光度在420 nm 波長處 4 min 內的時間歷程，取該曲線最初部分的斜率為酶反應的速度，酶反應速度最大時對應的 ph 值為漆酶的最適 ph 值。
查文獻知漆酶酶活最適ph為4.5。
3.3.1.3 漆酶稀釋倍數及酶活力的測定方法
取酶液0.1ml，加入hac-naac（ph4.5）緩衝液2.
5ml，混勻，加入abts0.4ml，放置30s，每15s讀取一次420nm下吸光值。共讀取6～7個數值。
以經驗判斷，若吸光值增長迅速，則將酶液稀釋2～5倍再次測定，直至吸光值數值變化不是太快，且數值均在0.2～0.8之間。
酶活的計算：吸光度變化的斜率×4000×稀釋倍數。
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