愈創木酚法測定活性酶定操作
一、實驗目的
過氧化物酶是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有密切關係，在植物生長發育過程中，它的活性不斷發生變化，因此測量這種酶，可以反映某一時期植物體內代謝的變化。通過本實驗了解過氧化物酶的作用，掌握愈創木酚法測定過氧化物酶。
二、實驗原理
在過氧化物酶（pod）催化下，h2o2將愈創木酚氧化成茶褐色產物。此產物在470 nm處有最大光吸收值，故可通過測470 nm下的吸光度變化測定過氧化物酶的活性。
四、裝置與試劑
分光光度計，tdl-5000b型低速冷凍多管離心機(r=18cm)，研缽，容量瓶，量筒，試管，吸管。0.05mol·l-1的磷酸緩衝液（ph5.
5），0.05 mol·l-1愈創木酚溶液，2％ h2o2。
五、實驗步驟
（一）酶液的製備
取1.0～5.0g洗淨去皮的馬鈴薯塊莖，切碎，放入研缽中，加適量的磷酸緩衝液研磨成勻漿。
將勻漿液全部轉入離心管中，於3000×g離心10min，上清液轉入25ml容量瓶中。沉澱用5ml磷酸緩衝液再提取兩次，上清液併入容量瓶中，定容至刻度，低溫下儲存備用。
（二）過氧化物酶活性測定
酶活性測定的反應體系：依次加入2.9ml0.
05mol·l-1磷酸緩衝液；1.0ml2％h2o2；1.0ml 0.
05mol·l-1愈創木酚和 0.1ml 酶液。用加熱煮沸 5min 的酶液為對照，反應體系加入酶液後，立即於 34℃水浴中保溫 3min，然後迅速稀釋 1倍，470nm 波長下比色，每隔1min記錄1次吸光度a470，共記錄5次，然後以每分鐘內a470變化0.
01為1個酶活性單位（u）。
六、實驗結果
以每分鐘內a470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位（u）。
w——馬鈴薯鮮重（g）；
t——反應時間（min）；
vt——提取酶液總體積（ml）；
vs——測定時取用酶液體積（ml）。
七、注意事項
酶液的的提取過程要盡量在低溫溫條件下進行。h2o2要在反應開始前加，不能直接加入。
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