生物化學實驗報告
題目：纖維素酶活力的測定（3,5-二硝基水楊酸法）
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一、 實驗目的：
掌握還原糖的測定原理，學習用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖的方法。
二、 實驗原理：
纖維素酶水解纖維素，產生纖維二糖、葡萄糖等還原糖，能將3,5-二硝基水楊酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，利用比色法測定其還原物生成量來表示酶的活力。
三、 實驗試劑：
1. 3,5-二硝基水楊酸顯色液：稱取10g 3,5-二硝基水楊酸，溶入蒸餾水中，加入20g分析純氫氧化鈉，200g酒石酸鉀鈉，加水500ml，公升溫溶解後，加入重蒸酚2g，無水亞硫酸鈉0.
5g。加熱攪拌，待全溶後冷卻，定容至1000ml。存於棕色瓶中，放置一周後使用。
2. 0.1摩爾ph4.5乙酸-乙酸鈉緩衝溶液。
3. 0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液，溶解後成膠狀液，靜置過夜。使用前搖勻。
4. 標準葡萄糖溶液：稱取乾燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解後定容至100ml，此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。
5. 酶液：將0.05g酶溶解定容至50ml，從中取出1ml再定容至100ml，待測。（用ph4.5乙酸-乙酸鈉緩衝溶液配製）
四、 實驗器材：
1. 比色管10支。
2. 722型分光光度計。
3. 滴管。
4. 水浴鍋。
5. 移液槍。
6. 電爐。
五、 實驗步驟：
1. 標準曲線的繪製：分別吸取0.
2，0.4，0.6，0.
8，1.0 ml的葡萄糖於5支比色管中，均用蒸餾水稀釋至1ml，加3.5-二硝基水楊酸顯色劑3ml，在沸水浴中煮沸顯色10分鐘，冷卻，加蒸餾水21ml，搖勻。
以1ml蒸餾水代替糖作空白管，在550nm處比色。以光密度為縱座標，以葡萄糖微g數為橫座標，繪出標準曲線。
2. 空白管的測定:取1ml酶液，沸水浴5分鐘，冷卻加3ml0.5%cmc，與樣品管同時放入50度水浴30分鐘。其它操作同樣品管。
3. 樣品的測定：取0.
5%羧甲基纖維素鈉溶液3ml，酶液1ml，於50度水浴中糖化30分鐘，取出，立即於沸水浴中煮沸10分鐘使酶失活，得糖化液，冷卻加入3ml顯色液，再沸水浴10分鐘，冷卻後加水定容至25ml，混勻，550nm測od值。
六、 實驗結果：
在上述條件下，1㎎酶每分鐘催化纖維素水解生成葡萄糖微克數定為乙個活力單位。
纖維素酶活力單位＝
n---酶液的稀釋倍數
30---糖化所用時間
1---反應酶液ml數
實驗測得的資料記錄如下：
表1 各比色管550nm od值
樣品550nm od值平均值= = 0.432。
作出標準曲線：
圖1 葡萄糖溶液550nm od值標準曲線
通過標準曲線可求得樣品中葡萄糖量為732μg，所以：
纖維素酶活力單位＝=2.44×103u/mg
所以每克固體酶的活力=2.44×103×103=2.44×106u
七、 注意事項：
1. 在測定od值過程中，繪製標準曲線時要用1號葡萄糖標準液（葡萄糖濃度為0）調零，測定樣品od值時要用樣品空白液調零。從實驗原理上看，這樣做的目的是：
無論是標準液還是樣品液，都要去除葡萄糖外的其他各種成分的對od值的影響。得到的標準曲線經過座標原點。
2. 用移液管或移液槍加各試劑時，不能將移液管或移液槍頭混用。
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