產纖維素酶真菌的分離、篩選與鑑定
一、取樣
在深圳大學或周邊地區採集林地或某些特殊樹木下的土樣，並做好記錄。取樣的準備：準備好滅菌的信封、合適的取樣器具（如小刀、鐵鏟等）、分離培養基等。
取樣的方法：取取樣地點的表層土或地面15cm下的土樣約10g，裝入信封，立刻到實驗室分離純化。每組至少取三個地點的土樣。
二、培養基：
（1） 查氏培養基：nano3 3.0g、kcl 0.
5g、feso4 0.01g、k2hpo4 1.0g、mgso4·7h2o 0.
5g、蔗糖20.0g、瓊脂20.0g、水1 000ml，ph值6.
7。（2） 馬丁氏培養基：kh2po4 1g、mgso4·7h2o 0.5g、蛋白腖 5g、葡萄糖 10g、瓊脂 20.0 g、水 1000ml，ph 自然。
（3） pda培養基：pda培養基：用於黎克特制木黴的固體培養，含20 %土豆浸出液，1 %葡萄糖，2 % agar。
20 %土豆浸出液作法如下：將土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置電爐上煮20分鐘，用紗布過濾，定容。
注：上述培養基可每個組選用2種，使用時需加入頭孢菌素、鏈黴素等抗生素100g/ml（瓊脂培養基冷卻至50℃左右時加入，然後倒平板），避免細菌瘋長。
產酶篩選培養基（cmc培養基）：羧甲基纖維素鈉（cmc）20.0 g、蛋白腖5.
0 g、酵母抽提物2.0 g、nacl 5.0g、kh2po4 1.
0g、mgso4·7h2o 0.2g、瓊脂20g、蒸餾水1 000ml。
1%cmcna底物溶液：1克cmcna加熱溶化於100ml ph值4.8，0.1mol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液中。
的檸檬酸一檸檬酸鈉緩
0.1mol/l檸檬酸含檸檬酸·h2o 21.01克/1000毫公升。
0.1mol/l的檸檬酸三鈉: 含檸檬酸三鈉·2h2o 29.4克/1000毫公升。
0.1mol/l的檸檬酸40ml與0.1mol/l的檸檬酸三鈉60.6ml混合即可。
剛果紅染液：2% 剛果紅溶液。
nacl脫色液：2%氯化鈉溶液。
三、實驗方法
3.1 真菌菌株的分離
取土樣方法如前所述。取1.0 g所採集的土樣加入到裝有9 ml無菌水的試管中，充分振盪混勻後，吸取上清液作一系列梯度稀釋，10-1，10-2，10-3，將稀釋液塗佈在分離培養基（可選擇查氏、馬丁氏或pda培養基的任兩種，倒平板前加入100 g/ml頭孢菌素或鏈黴素等抗生素），於28℃下培養，待菌落成熟，形成孢子後（約需5-7 d）將單菌落上的少量孢子點種至纖維素酶產生菌篩選培養基 （cmc平板）平板上( 用前加入適量抗生素來抑制細菌生長) , 28℃倒置恆溫培養。
培養5-7d後用剛果紅染色、nacl 脫色後篩選菌落周圍有明顯透明水解圈的菌株。
將篩選到的菌種由平板接到50ml( 250 ml 三角瓶) 液體培養基中, 於28℃、20 r/min下培養24 h, 製成種子液。然後按5%的接種量將種子液加到50 ml( 250 ml 三角瓶) 相應液體培養基中，於28℃、210 r·min- 1 條件下培養5-7d, 測定cmc酶活。
3.2 酶活力測定方法
精確稱量0.1 g的d-葡萄糖溶於0.05 m的檸檬酸緩衝液中，用容量瓶定容到100 ml，葡萄糖濃度為1.
0 mg/ml；將其依次稀釋到0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.
3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.
6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.
9 mg/ml、1.0 mg/ml，這就是一組標準的葡萄糖溶液；在試管中加入1 ml 標準葡萄糖溶液和3 ml dns 試劑，沸水浴 5 分鐘，冷卻至室溫後，加水至 25 ml，搖勻。以0.
05 m的檸檬酸緩衝液為空白，在酶標儀上測540 nm 處的od值；以葡萄糖濃度（mg/ml）為橫座標，od值為縱座標，作出標準曲線，並回歸出工作方程。
纖維素酶濾紙酶活力的測定方法是根據纖維酶能將濾紙酶解成葡萄糖的特性而設計。乙個fpa國際單位等於酶水解反應中每分鐘由濾紙生成1mol葡萄糖的酶量，以u/ml來表示。本文測定的是：
①轉化子的濾紙酶活。取3支25 ml的比色管，編號為1，2，3；分別加入1 ml ph 4.5，0.
05 m的檸檬酸緩衝液和0.05g的濾紙條；向1號管中加入1 ml滅活的上述轉化子上清（在沸水中將上清煮沸10 min），2號和3號管中加入1 ml未滅活的上清；50 ℃，100 r/min振盪水浴30 min；加入3 ml dns，沸水煮沸5 min，冷卻後加水定容到25 ml；充分混合，取200 ml加到96孔酶標板上，在酶標儀上測540 nm處的od值；根據預先作好的葡萄糖標準曲線算出酶反應過程所釋放的葡萄糖量。
其酶活定義為每分鐘酶解cmc產生1μmol的還原糖（葡萄糖）所需的酶量定義為乙個酶活單位[87]，本文測定的是：
①轉化子的cmc 酶活。取3支25 ml的比色管，編號為1，2，3；分別加入1 ml 1 %的cmc溶液（用ph4.5，0.
05 m的檸檬酸緩衝液配製）；向1號管中加入0.5 ml滅活的上述轉化子上清，2和3號管中加入0.5 ml未滅活的上清；50 ℃，100 r/min振盪水浴15 min；加入3 ml dns，沸水煮沸5 min，冷卻後加水定容到25 ml；充分混合，取200 ml加到96孔酶標板上，在酶標儀上測540 nm處的od值；根據預先作好的葡萄糖標準曲線算出酶反應過程所釋放的葡萄糖量。
3.3 菌株的鑑定：
菌株的鑑定初步採用形態鑑定方法。觀察菌株的菌落特徵，並製片觀察菌絲、分生孢子梗、分生孢子鏈、分生孢子等形態，參考有關產纖維素酶菌株的菌種鑑定文獻，同時結合《真菌鑑定手冊》，初步給出菌株的屬名。
直接製片觀察法 ：
在載玻片上加一滴乳酸石炭酸棉藍染色液，用解剖針從黴菌菌落邊緣處挑取少量已產孢子的黴菌菌絲，先置於50%乙醇中浸一下以洗去脫落的孢子，再放在載玻片上的染液中，用解剖針小心地將菌絲分散開。蓋上蓋玻片，置低倍鏡下觀察，必要時換高倍鏡觀察。
注意：挑菌和製片時要細心，盡可能保持黴菌自然生長狀態；加蓋玻片時勿壓入氣泡，以免影響觀察。
2.載玻片培養觀察法
（1）培養小室的滅菌在平皿皿底鋪一張略小於皿底的圓慮紙片，再放一u形玻棒，其上放一潔淨載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，包紮後於121度滅菌30分鐘，烘乾備用。
（2）瓊脂塊的製作取已滅菌的馬鈴薯瓊脂培養基6~7毫公升注入另一滅菌平皿中，使之凝固成薄層。用解剖刀切成0.5~1平方厘公尺的瓊脂塊，並將其移至上述培養室中的載玻片上（每片放兩塊）。
製作過程應注意無菌操作
（3）接種用尖細的接種針挑取很少量的孢子接種於瓊脂塊的邊緣上，用無菌鑷子將蓋玻片覆蓋在瓊脂塊上。
接種量要少，盡可能將分散的孢子接種在瓊脂塊的邊緣上，否則培養後菌絲過於稠密影響觀察。
（4）培養先在平皿的慮紙上加3~5毫公升滅菌的20%甘油（用於保持平皿內的濕度），蓋上皿蓋，28度培養。
（5）鏡檢根據需要可以在不同的培養時間內取出載玻片置低倍鏡下觀察，必要時換高倍鏡。
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