第３０卷第４期２０１１年７月
浙江海洋學院學報（自然科學版）
ｊｕｌｙ，２０１１
文章編號
菲律賓蛤仔醣蛋白提取及體外抗腫瘤活性研究
鬱迪 ，楊永芳，王加斌ｚ，楊最素 ，黃芳芳，鄭玉寅 ，李榮 ，丁國芳
（１．浙江海洋學院食品與藥學學院，浙江舟山３１６００４；２．浙江海力生製藥****，浙江舟山３１６０２１）
摘要：以菲律賓蛤仔肉為研究物件，水提醇沉，ｓｅｖａｇ法除蛋白陰離子交換層析柱分離純化，
ｓｅｐｈａｄｅｘｇ一２５凝膠柱除鹽，得到１種白色組分，紅外顯示該組分具有醣蛋白的一般吸收特徵。將該醣蛋白作用於前列腺癌
細胞ｄｕ一１４５進行體外藥物敏感性實驗，結果顯示，ｏ．１ｍｏｌ／ｌ氯化鈉溶液的洗脫峰組分對ｄｕ一１４５細胞具有明顯增殖抑制作用，最適作用濃度約為２５ ｍｇ／ｍｌ，表明菲律賓蛤仔具有潛在的抗腫瘤作用。
關鍵詞：菲律賓蛤仔；醣蛋白；抗腫瘤活性中圖分類號
文獻標識碼：ａ
菲律賓蛤仔屬軟體動物門ｍｏｌｌｕｓｃａ、瓣鰓綱簾蛤科ｖｅｎｅｒｉ—
ｄａｅ，山東稱蛤蜊，廣泛分布在我國南北海區。菲律賓蛤仔肉蛋白質量較高，脂肪含量較低，且含維生素和微
量元素豐富，是較好的海洋生物功能食品。最新研究結果表明，菲律賓蛤仔肉組織中的所含的活性物質具
有抗癌、改善症狀、延長病人生命、提高免疫力、抗動脈粥樣硬化等作用［１－３］。醣蛋白廣泛存在於生物體內，
是蛋白質和醣類的共價複合物，具有很多重要功能。它既是激素、凝集素、酶、毒素、病毒和細菌等的識別
收稿日期
**專案：浙江省自然科學**專案浙江省教育廳院生創新科研專案浙江省新苗人才討劃專案
舟山市科技計畫海洋專項（０９２ｏ１６）
作者簡介：鬱迪（１９６７一），男，浙江舟山人，研究方向：海洋生物製品、海洋藥物．
通訊作者：丁國芳，教授，碩士生導師，研究方向：海洋生物製品、海洋藥物
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點，也是細胞表面抗原、糖分化抗原和癌發育抗原，在細胞訊號轉導過程中具有十分重要的作用 ，目前，從海洋生物中分離純化得到醣蛋白並研究其抗癌作用已有報道￣７－９］。筆者經離子交換和凝膠層析等方法分離純化得到具有較強活ｆ生的醣蛋白，並對其化學結構及體外對人腫瘤細胞的增殖抑制活性進行了初步研究。以期為菲律賓蛤仔的深度開發提供基礎資料。
１材料與方法
１．１動物與試劑
菲律賓蛤仔採於舟山活鮮市場，經專家鑑定後，取其肉，立即冷藏於一２０℃冰箱備用陰離子交換柱購自於北京亞太恆信生物科技****；ｍｔｒ試劑盒、培養基和胰蛋白酶購於ｓｉｇｍａ公司，二甲基亞碸購於美國ａｍｒｅｓｃｏ公司一２５凝膠購自上海如吉生物科技****；其
餘試劑均為分析純。１．２主要儀器
採用ｈｄ一２１—８８蛋白檢測儀、ｂｓｚ一４０一ｌｃｄ自動部分收集器、ｂｓａ１２４ｓ型電子天平、ｄｓ一１型高速組織
搗碎機紅外光譜儀、ｃｆ１６ｒｘｉｉ高速冷凍離心機；ｕ２８００型紫外可見分光光度計型超淨工作台型ｃｏ２培養箱、ｏｌｙｍｐｕｓ倒置顯微鏡、ｂｉｏ—ｒａｄ酶標儀等。
１．３菲律賓蛤仔醣蛋白提取純化工藝１．３．１醣蛋白提取
將３００ｇ蛤肉組織機械絞碎，然後加３倍體積蒸餾水，９０ｃｃ水浴抽提４ｈ，２層紗布過濾。將殘渣加３倍體積蒸餾水，９０ｑｃ水浴抽提３ｈ，兩層紗布過濾，合併２次濾液離心１０ｍｉｎ，收集上清液。５０ｑｃ減壓濃縮至８００ｍｌ，加入４倍體積無水乙醇，４℃靜置過夜。
小心傾去上清液，收集沉澱。然後４℃下離心１０ｍｉｎ收集沉澱。將沉澱真空冷凍乾燥，得粗提物。
１．３．２粗提物的色譜分離純化
準確稱取乾燥物樣品４．３ｇ，室溫下加入２００ｍｌ去離子水溶解搖勻。取氯仿一正丁醇（體積比為４：１）溶液４０ｍｌ加入溶液中，４℃靜置過夜。
將上清液倒出，重複上述過程，共計２次。將上清液冷凍乾燥，然後過離子交換層析柱，ｎａｃ１溶液洗脫分３個濃度進行，分別為：０．１、０＿３和０．５ｍｏｌ／ｌ，洗脫速度１ｍｌ／ｍｉｎ，每管４ｍｌ進行收集，紫外２８０ｎｍ檢測蛋白峰，同時採用苯酚一硫酸法檢測糖峰，收集峰
值洗脫液，用一２５凝膠柱除鹽，冷凍乾燥後備用。１．４聚丙烯醯胺凝膠電泳分析
採用１５％的ｓｄｓ—ｐａｇｅ電泳膠，考察純化後醣蛋白的電泳行為，用考馬斯亮藍法進行染色。１．５醣蛋白理化性質分析
１．５．１糖與蛋白含量測定
糖含量測定採用苯酚一硫酸法，以葡萄糖為標準品；蛋白含量測定採用ｆｏｌｉｎ一酚法，以牛血清白蛋白作
為標準品。
１．５．２紫外和紅外光譜
紫外光譜掃瞄範圍為檢測峰值所在波長。紅外光譜採用溴化鉀壓片法，在之間掃瞄。
１．６菲律賓蛤仔提取純化物活性測定
１．６．１細胞培養
取購自中國科學院上海生物細胞所細胞庫的ｄｕ一１４５細胞株，由本實驗室傳代儲存，用１０％ｓｂ牛血清的ｒｐｍｉ１６４０完全培養基於溫度為３７ｏｃ，ｃｏ：濃度為５％的培養箱中培養至對數生長期。１．６．２測定細胞增殖抑制率
檢測用ｍｔｒ法。菲律賓蛤仔醣蛋白溶液的配製濃度分別為取對數生長期的細胞製成懸液，接種於９６培養孔板中，每孑ｌ為２００ｉｘｌ，培養於ｃｏ：濃度為５％、培養箱溫度為３７℃，貼
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壁４ｈ，之後分別加人不同濃度的菲律賓蛤仔醣蛋白溶液，每種濃度建３個平行孑ｌ，同時設對照組進行對４９０ｎｍ測吸光度，計算ｉｒ（細胞增殖抑制指數），計算公式見下：
ｉｒ＝『（對照組值一藥物組值）／對照組ａ值］ｘ１００％
１．７資料處理
照，在５％的ｃ０２、３７℃培養箱中孵育４８ｈ，然後加ｍｔｔ繼續培養４ｈ，再吸去ｍｔｔ，在酶聯免疫檢測儀上
每個組測定的實驗資料均做３個平行實驗，取平均值為其結果。
２結果２．１分離純化
經水提醇沉後共得到６．５ ｇ醣蛋白粗品。取４．３ ｇ離子
交換後得到１、２和３共３個峰，分別經紫外和苯酚一硫酸法檢測，其中，峰２的蛋白峰和糖峰重合較好，且該峰峰值最高（圖１），為溶液的洗脫組分，收集該峰，經越ｓ凝膠除鹽，冷凍乾燥後得到１．白色粉末基，ｚ－１
一９６ ｇ
狀易吸潮物質，得率為電泳資料結果
峰２組分經ｓｄｓ—ｐａｇｅ電泳，ｂｒａｄｆｏｒｄ染色顯示為單
一條帶，如圖２。
經檢測，圖１中峰２組分的糖含量為５３．１３％，蛋白含量
管排數２－３理化性質
圖１醣蛋白洗脫圖譜
為３８．６４％，易溶於水；紫外全波長掃瞄顯示，峰２組分在
２６８ｎｍ處有特徵吸收，如圖３；紅外光譜掃瞄結果表明，在一１處，有羥基伸縮振動峰一１處，是ｃ—ｈ伸縮振動峰，這２個峰是醣類化合物典型的特徵吸收峰；
一１附近有強吸收，示有醯胺鍵的ｃ＝ｏ鍵伸縮振動及ｎ—ｈ鍵的變角振動，是蛋白典型吸收峰一１是ｃｏ０一的吸收峰一１是ｃ—ｏ—ｃ和ｃ—ｏ—ｈ
伸縮振動。在８４０ ｃｍ－－附近無吸收峰，在８８０ ｃｍ一１有吸收
峰，說明多醣部分可能以ｂ一糖苷鍵連線［１０－１１］。光譜掃瞄結果
表明，本實驗所提取的峰２組分是糖和蛋白的複合物。２．４菲律賓蛤仔醣蛋白對ｄｕ一１４５細胞增殖的作用
圖２醣蛋白電泳圖
不同濃度的菲律賓蛤仔醣蛋白作用於ｄｕ一１４５細胞４８ｈ後，癌細胞出現明顯的增殖抑制現象，而且隨著濃度的增加抑制率逐漸增大，半數抑制濃度約為當濃度為３０ｍｇ／ｍｌ時，抑制率達到７２．４９％，見表ｌ。
３討記ｌ
ａ／ｎｍ
本實驗中的提取物峰２組分在陰離子交換層析圖譜中顯示糖峰和蛋白峰完全重合，經ｂｒａｄｆｏｒｄ染色電泳圖中顯示為單一條帶，紅外光圖譜顯示其具有糖和蛋白的特徵吸
收峰，因此判斷該提取物可能為純度較高的單一醣蛋白。該醣蛋白體外對ｄｕ一１４５細胞具有顯著的增殖抑制活性，當濃度為１５２５ｍｇ／ｍｌ時，對癌細胞的增殖抑制作用明顯增強，
圖３醣蛋白全波長紫外掃瞄圖
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注：上標｝表示與對照組差異顯著（屍＜０．０５）．
之後趨於平緩，因此判斷醣蛋白對ｄｕ一１４５細胞的最適作用濃度約為２５ ｍｇ／ｍｌ。由於醣蛋白的結構和活
性功能比單純的醣類和蛋白質類複雜，因此對於本實驗中所提取的醣蛋白的分子量和一級結構還有待於進一步研究。此外，為了全面評價抗前腺癌活性，還應測定其對前列腺癌細胞其它瘤譜的抑制作用，並且進行體內實驗和活性作用機理研究對於將其開發成藥品或保健品也是必不可少的環節。
參考文獻：
…１範秀萍，吳紅棉，王婭楠，等．菲律賓蛤仔醣胺聚醣的免疫活性研究［ｊ］．食品科學
一［３】張莉，劉７ｙｊ￣，，韓寶芹，等．菲律賓蛤仔蛋白聚醣的分離提取及其抗腫瘤活性的初步研究［ｊ］．海
洋與湖沼
［４］肖瑩．醣蛋白生物活性研究綜述［ｊ】．現代農業科學郭
慧，鄧文星，張
映．醣蛋白的研究進展［ｊ】．生物技術通報
［７】張柏，吳梧桐．抗腫瘤文蛤醣肽（ｍｇｐ０４０５）的分離純化及性質研究［ｊ］．中國天然藥物
．［８】顧謙群，方玉春，辛現良，等．櫛孔扇貝醣蛋白的腫瘤抑制活性和對免疫功能的影響［ｊ１．營養學報韓雅莉，謝【１１］陳登龍，房
昆．土鱉蟲醣蛋白的提取及抗腫瘤活性初步研究［ｊ］．汕頭大學學報：自然科學版幹，姚清華，等．傅利葉紅外光譜研究重組蛛絲蛋白分子構象的影響因素［ｊ】．高分子材料與工程
［１ｏ］徐明生，曾婷婷，蔣豔，等．河蜆免疫活性醣蛋白分離及結構初步分析【ｊ］．食品科學
，２００９，２５
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