大學有機化學實驗教學
之菠菜色素的提取和柱層析分離
一、 目的與任務:
（1） 目的：通過菠菜色素的提取和色素分離，了解從天然物中分離活性有機化合物的過程和基本操作。
（2） 任務：學習薄層板的製備，菠菜色素的提取和色素分離及化合物rf值的測定
二、 內容、要求與安排方式：
1. 本實驗涉及天然物提取、萃取技術及tlc技術三個知識點。
（1） 2．內容和要求:
（2） 薄層板的製備。
（3） 菠菜色素的提取。
（4） 薄層層析分析及化合物rf值的測定。
（5） 3．實驗安排方式本實驗為專業實驗，學科部統一安排。可同時16組進行實驗，每組2人。。
三、 實驗目的
1、 通過綠色植物色素的提取和分離，了解天然物質分離提純方法；
2、 通過柱色譜和薄層色譜分離操作，加深了解微量有機物色譜分離鑑定的原理。
四、 實驗原理
1. 綠色植物如菠菜葉中含有葉綠素（綠）、胡蘿蔔素（橙）和葉黃素（黃）等多種天然色素。
2. 葉綠素存在兩種結構相似的形式即葉綠素a(c55h72o5n4mg)和葉綠素b(c55h70o6n4mg)，其差別僅是葉綠素a中乙個甲基被甲醯基所取代從而形成了葉綠素b。它們都是吡咯衍生物與金屬鎂的絡合物，是植物進行光合作用所必需的催化劑。
植物中葉綠素a的含量通常是b的3倍。儘管葉綠素分子中含有一些極性基團，但大的烴基結構使它易溶於醚、石油醚等一些非極性的溶劑。
3. 胡蘿蔔素（c40h56）是具有長鏈結構的共軛多烯。它有三種異構體，即-胡蘿蔔素、β-胡蘿蔔素和γ-胡蘿蔔素，其中β-胡蘿蔔素含量最多，也最重要。
在生物體內，β-胡蘿蔔素受酶催化氧化形成維生素a。目前β-胡蘿蔔素已可進行工業生產，可作為維生素a使用，也可作為食品工業中的色素。
4. 葉黃素（c40h56o2）是胡蘿蔔素的羥基衍生物，它在綠葉中的含量通常是胡蘿蔔素的兩倍。與胡蘿蔔素相比，葉黃素較易溶於醇而在石油醚中溶解度較小。
五、 主要儀器與試劑
1. 儀器：研缽、布氏漏斗、圓底燒瓶、直形冷凝管、層析缸
2. 試劑：矽膠g，中性氧化鋁，甲醇，石油醚（60-90℃），丙酮，乙酸乙酯，菠菜葉。
六、 實驗流程
七、 八、 操作步驟
1、 菠菜色素的提取
2. 稱取2g洗淨後的新鮮（或冷凍）的菠菜葉，用剪刀剪碎並與10ml甲醇拌勻，在研缽中研磨約5min然後用布氏漏斗抽濾菠菜汁，棄去濾渣。
3. 將菠菜汁放回研缽，每次用10ml 3:2（體積比）的石油醚-甲醇混合液萃取兩次，每次需加以研磨並且抽濾。
合併深綠色萃取液，轉入分液漏斗，每次用5ml水洗滌兩次，以除去萃取液中的甲醇。洗滌時要輕輕旋蕩，以防止產生乳化。棄去水-甲醇層，石油醚層用無水硫酸鈉乾燥後濾入圓底燒瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至體積約為1ml為止。
九、 2、薄層層析
1. 取四塊顯微載玻片，用矽膠g加0.5%羧甲基纖維素調製後製板，晾乾後在110℃活化1h。
2. 展開劑：（a）石油醚-丙酮=8:2（體積比）
一十、 （b）石油醚-乙酸乙酯=6:4（體積比）
1. 取活化後的層析板，點樣後，小心放入預先加入選定展開劑的廣口瓶內，蓋好瓶蓋。待展開劑上公升至規定高度時，取出層析板，在空氣中晾乾，用鉛筆做出標記，並進行測量，分別計算出rf值。
2. 分別用展開劑a和b展開，比較不同展開劑系統的展開效果。觀察斑點在板上的位置並排列出胡蘿蔔素、葉綠素和葉黃素的rf值的大小次序。注意更換展開劑時，須乾燥層析瓶。
一十一、 3、柱層析
1. 在層析柱中，加3cm高的石油醚。另取少量脫脂棉，先在小燒杯用石油醚浸濕，擠壓以驅除氣泡，然後放在層析柱底部，輕輕壓緊，塞住底部。
將3g層析用的中性氧化鋁（150~160目），從玻璃漏斗中緩緩加入，小心開啟柱下活塞，保持石油醚高度不變，流下的氧化鋁在柱子中堆積。必要時用橡皮錘輕輕在層析柱的周圍敲擊，使吸附劑裝得均勻緻密。柱中溶劑面由下端活塞控制，既不能滿溢，更不能乾涸。
裝完後，上面再加一片圓形濾紙，開啟下端活塞，放出溶劑，直到氧化鋁表面溶劑剩下1~2mm高時關上活塞（注意！在任何情況下，氧化鋁表面不得露出液面）。
2. 將上述菠菜色素的濃縮液，用滴管小心地加到層析柱頂部，加完後，開啟下端活塞，讓液面下降到柱面以上1mm左右，關閉活塞，加數滴石油醚，開啟活塞，使液面下降，經幾次反覆，使色素全部進入柱體。
3. 待色素全部進入柱體後，在柱頂小心加洗脫劑—石油醚-丙酮溶液9:1（體積比）。
開啟活塞，讓洗脫劑逐滴放出，層析即開始進行，用錐形瓶收集。當第乙個有色成分即將滴出時，取另一錐形瓶收集，得橙黃色溶液，它就是胡蘿蔔素。
4. 用石油醚-丙酮7:3（體積比）作洗脫劑，分出第二個黃色帶，它是葉黃素（1）。再用丁醇-乙醇-水3:1:1（體積比）洗脫葉綠素a（藍綠色）和葉綠素b（黃綠色）。
一十二、 注釋
（1） 葉黃素易溶於醇而在石油醚中溶解度較小，從嫩綠菠菜得到的提取液中，葉黃素含量很少，柱色譜中不易分出黃色帶。
一十三、 思考題
1、 試比較葉綠素、葉黃素和胡蘿蔔素三種色素的極性，為什麼胡蘿蔔素在層析柱中移動最快？
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