一、形態結構和培養特性觀察
１、微生物的形態結構觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構（包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態結構上特性，根據不同微生物在形態結構上的不同達到區別、鑑定微生物的目的。
２、細菌細胞在固體培養基表面形成的細胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養基中生長繁殖，所形成的菌落特徵有很大差異，而同一種的細菌在一定條件下，培養特徵卻有一定穩定性。，以此可以對不同微生物加以區別鑑定。
因此，微生物培養特性的觀察也是微生物檢驗鑑別中的一項重要內容。
１）細菌的培養特徵包括以下內容：在固體培養基上，觀察菌落大小、形態、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質地、隆起形狀、邊緣特徵及遷移性等。在液體培養中的表面生長情況（菌膜、環）混濁度及沉澱等。
半固體培養基穿刺接種觀察運動、擴散情況。
２）黴菌酵母菌的培養特徵：大多數酵母菌沒有絲狀體，在固體培養基上形成的菌落和細菌的很相似，只是比細菌菌落大且厚。液體培養也和細菌相似，有均勻生長、沉澱或在液面形成菌膜。
黴菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養基裡，菌絲無限伸長沿培養基表面蔓延。黴菌的基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青黴菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內菌絲褐色。
黴菌在固體培養表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網狀菌落。
革蘭氏染色:
革蘭氏染色法是2023年由丹麥病理學家所創立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（g+）和革蘭氏陰性菌（g—）兩大類，是細菌學上最常用的鑑別染色法。
該染色法所以能將細菌分為g+菌和g—菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。g—菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚醣層較薄、交聯度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的複合物易於滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅復染後就成紅色。g+菌細胞壁中肽聚醣層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理後反而使肽聚醣層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色
步驟：（1）塗片：塗片方法與簡單染色塗片相同。
（2）晾乾：與簡單染色法相同。
（3）固定，與簡單染色法相同
（4）結晶紫色染色：將玻片置於廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細菌塗面）的結晶紫染色液染色1分鐘。
（5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。
（6）媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。
（7）水洗：用水洗去碘液。
（8）脫色：將玻片傾斜，連續滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無色，立即水洗。
（9）復染：滴加蕃紅復染5min。
（10）水洗：用水洗去塗片上的蕃紅染色液。
（11）晾乾：將染好的塗片放空氣中晾乾或者用吸水紙吸乾。
（12）鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最後用油鏡觀察，並判斷菌體的革蘭氏染色反應性。
（13）實驗完畢後的處理：
①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭乾淨，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.
用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2—3次。c.再用乾淨的擦鏡紙將鏡頭擦2—3次。
注意擦鏡頭時向乙個方向擦拭。
②看後的染色玻片用廢紙將香柏油擦乾
aseptic technique:
streak plate:
二、生理生化試驗
微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物，生化反應常用來鑑別一些在形態和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑑定中的重要依據之一。
微生物檢驗中常用的生化反應有：
1、尿素酶（urease）試驗
有些細菌能產生尿素酶，將尿素分解、產生2個分子的氨，使培養基變為鹼性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導酶，因為不論底物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。其活性最適ph為7.0。
試驗方法：挑取18~24h待試菌培養物大量接種於液體培養基管中，搖均，於36±1℃培養10，60和120min，分別觀察結果。或塗佈並穿刺接種於瓊脂斜面，不要到達底部，留底部作變色對照。
培養2，4和24h分別觀察結果，如陰性應繼續培養至4天，作最終判定，變為粉紅色為陽性。
2、氧化酶（oxidase）試驗
氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素c氧化，然後此氧化型細胞色素c再使對苯二胺氧化，產生顏色反應。
試驗方法：在瓊脂斜面培養物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽性者kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色，ewing氏改進試劑呈藍色。陰性者無顏色改變。
應在數分鐘內判定試驗結果。
注意事項：
（1） 鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液容易氧化，溶液應裝在棕色瓶中，並在冰箱內儲存，如溶液變為紅褐色，即不宜使用。
（2） 鐵、鎳鉻絲等金屬可催化二甲基對苯撐二胺呈紅色反應，若用它來挑取菌苔，會出現假陽性，故必須用白金絲或玻璃棒（或牙籤）來挑取菌苔。
（3） 在濾紙上滴加試劑，以剛剛打濕濾紙為宜，如濾紙過濕，會防礙空氣與菌苔接觸，從而延長了反應時間，造成假陰性。
3、過氧化氫酶的測定
過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解水和氧。
1． 試劑：3－10％過氧化氫（h2o2）
2． 菌種培養：將測試菌種接種於合適的培養基斜面上，適溫培養18－24h。
3． 試驗方法：取一乾淨的載波片，在上面滴1滴3－10％的h2o2，挑取1環培養18－24h的菌苔，在h2o2溶液中塗抹，若有氣泡（氧氣）出現，則為過氧化氫酶陽性，無氣泡者為陰性。也可將過氧化氫溶液直接加入斜面上，觀察氣泡的產生。
4． 注意事項：過氧化氫酶是1種以正鐵血紅素作為輔基的酶，所以測試菌所生長的培養基不可含有血紅素或紅血球。
4、甲基紅（methyl red）試驗
腸桿菌科各菌屬都能發酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸，進一步分解中，由於糖代謝的途徑不同，可產生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物，可使培養基ph值下降至ph4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。
試驗方法：挑取新的待試純培養物少許，接種於mr－vp生化鑑定管，於36通用培養基，培養於36±1°c或30°c（以30°c較好）3~5天，從第二天起，每日取培養液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發現陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結果。
甲基紅為酸性指示劑，ph範圍為4.4~6.0，其pk值為5.
0。故在ph5.0以下，隨酸度而增強黃色，在ph5.
0以上，則隨鹼度而增強黃色，在ph5.0或上下接近時，可能變色不夠明顯，此時應延長培養時間，重複試驗。
5、v-p試驗
某些細菌在葡萄糖蛋白腖水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙醯甲基甲醇，後者在強鹼環境下，被空氣中氧氧化為二乙醯，二乙醯與蛋白腖中的胍基生成紅色化合物，稱v－p（+）反應。
試驗方法：
１）o』meara氏法：將試驗菌接種於通用培養基，於36±1°c培養48h，培養液1ml加o』meara試劑（加有0.3%肌酸creatine或肌酸酐creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動試管1~2min，靜置於室溫或36±1°c恆溫箱，若4h內不呈現伊紅、即判定為陰性。
亦有主張在48~50°c水浴放置2h後判定結果者。
２）barritt氏法：將試驗菌接種於通用培養基，於36±1°c培養4天、培養液2.5ml先加入5°cα萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.
6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動2~5min，陽性菌常立即呈現紅色，若無紅色出現，靜置於室溫或36±1°c恆溫箱，如2h內仍不顯現紅色、可判定為陰性。
３）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放於小試管中、挑取產酸反應的三糖鐵瓊脂斜面培養物一接種環，乳化接種於其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動後放置5min，判定結果。
不產酸的培養物不能使用。
本試驗一般用於腸桿菌科各菌屬的鑑別。在用於芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細菌時，通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙醯甲基醇的產生，故應省去或以氯化鈉代替。
6、含碳化合物的利用
細菌能否利用某些含碳化合物作為唯一碳源，反映該菌是否產生代謝這種化合物的有關酶系，因而作為鑑定依據。測定的基礎培養基配方很多，因種而異。現介紹1種合成的基礎培養基，有些細菌還可適當補加各種維生素。
培養基可製成液體，分裝試管，也可製成固體平板。可用於測定的底物種類很多，有單醣、雙醣、糖醇、脂肪酸、羥基酸及其他有機酸、醇、各種氨基酸類胺類以及碳氫化合物等。糖的含量一般為1％，醇類酚類等的含量一般為0.
1－0.2％，氨基酸的含量一般為0.5％。
因碳氫化合物不溶於水，可在液體培養基中振盪培養，或加入到45℃的固體培養基中，振盪後立即倒成平板。有些底物不宜用高壓滅菌，可用過濾法滅菌後加入已滅菌的基礎培養基中，某些醇類和酚類不必滅菌。
接種和觀察結果：菌種最好做成懸液，避免帶入少量碳源干擾試驗結果。平板培養用接種環點種，液體培養則用直針接種。每一測定菌必須接種未加碳水化合物的空白基礎培養基作對照。
適溫培養2、5、7天後觀察，凡測定菌在有碳水化合物的培養基中生長情況，明顯超過空白培養基的生長量為陽性，否則為陰性。假若兩種培養基上生長情況差別不明顯，開在同一培養基上連續移種3次，如差別仍不明顯則以陰性論。
7、葡萄糖的氧化發酵試驗
在細菌鑑定中，醣類發酵產酸是1項重要依據。細菌對醣類的利用有2種型別：1種是從醣類發酵產酸，不需要以分子氧作為最終受氫體，稱發酵型產酸；另一種則以分子氧作為最終受氫體，稱氧化型產酸。
前者包括的菌種型別為多數。氧化型產酸量較少，所產生的酸常常被培養基中的蛋白腖分解時所產生的胺所中和，而不表現產酸。為此，hugh和leifson提出一種含有低有機氮的培養基，用以鑑定細菌從醣類產酸是屬氧化型產酸或發酵型產酸。
這一試驗廣泛用於細菌鑑定。一般用葡萄糖作為醣類代表。也可利用這一基礎培養基來測定細菌從其他醣類或醇類產酸的能力。
（1）接種 ：以18－24h的幼齡菌種，穿刺接種在上述培養基中，每株菌接4管，其中2管用油封蓋（凡士林：液體石蠟＝1：
1混合後滅菌），約加0.5－1厘公尺厚，以隔絕空氣為閉管。另2管不封油為開管，同時還要有不接種的閉管作對照。
適溫培養1、2、4、7天觀察結果。
（2）結果觀察：氧化型產酸――僅開管產酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產鹼（1－2d），後來才稍變酸。發酵型產酸則開管及閉管均產酸，如產氣，則在瓊脂柱內產生氣泡。
8、糖或醇類發酵試驗
不同微生物分解利用醣類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產氣或不產氣。可用指示劑及發酵管檢驗。
試驗方法：以無菌操作，用接種針或環移取純培養物少許，接種於發酵液體培養基管，若為半固體培養基，則用接種針作穿刺接種。接種後，置36±1.
0°c培養，每天觀察結果，檢視培養基顏色有無改變（產酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產氣陽性，若為半固體培養基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力、培養物可呈瀰散生長。
微生物常規生化鑑定技術
一 形態結構和培養特性觀察 微生物的形態結構觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀 大小 排列方式 細胞結構 包括細胞壁 細胞膜 細胞核 鞭毛 芽孢等 及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態結構上特性，根據不同微生物在形態結構上的不同達到區別 鑑定微生物的目的。細菌細胞在固體培養基表面形成的細胞群...
微生物檢測技術實驗
海南大學 實驗教學自編教材 微生物檢測技術實驗 農學院生物技術系編 實驗一細菌學鑑定中常用的生化反應實驗 一 目的要求 了解細菌鑑定中常用的生化反應及其原理。二 基本原理 微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物。生化反應常用來鑑別一些在形態和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是...
微生物總結
二 免疫學基本理論要點 免疫學的主要內容 共7章，重點在1 抗原 2 免疫球蛋白 5 免疫應答 章 1 免疫概念以及免疫系統的功能 免疫 指機體免疫系統識別自身與異己抗原，並通過免疫應答排除抗原性異物，以維持機體生理平衡的功能。p5 免疫系統功能 免疫防禦 排斥外來抗原性異物 免疫自穩 清除衰老 損...