實驗一微生物培養基的配製和滅菌
培養基是將微生物生長繁殖所需要的各種營養物質，用人工方法配製而成的各種營養基質。它具有微生物正常生活所需的各種養料和適宜的環境條件：(1)適當組分和比例的營養物質；(2)適宜的ph值；(3)合適的滲透壓；(4)保持無菌狀態。
所以培養基是培養微生物所必需的最主要材料。培養基的配製是微生物工作者的主要技術操作之一。
一、實驗目的與耍求：
1．了解培養基的配製原理和方法，掌握其配製過程。
2．了解幾種滅菌方法，掌握乾熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。
3．熟悉分離、培養微生物前的有關準備工作及操作方法。
二、實驗原理與材料：
(一) 培養基的種類
根據培養基的組成成分，可將培養基分為三類：合成培養基：由各種純化學物質按一定比例配製而成。
半合成培養基：由一部分純化學物質和另一部分天然物質配製而成。
天然培養基：利用天然**的有機物配製而成的。
從培養基的物理狀態來分：
液體培養基：不加凝固劑。
固體培養基：在液體培養基中加2％左右的凝固劑。
半固體培養基：在液體培養基中加入0.2％一0.5％凝固劑。
微生物最常用的凝固劑為瓊脂(其次為明膠)，又叫洋菜、凍粉。它不是一種營養物質，只能被極少數種類的細菌分解利用。瓊脂是從海藻中(主要是石花菜)提取而製成的。
是一種多醣類化合物，主要成分是複雜的多醣硫酸酯鈣鹽，瓊脂是一種可逆性膠體，在常規濃度下加熱到96℃以上即成溶膠狀態，融化的瓊脂，當溫度下降到42℃以下，又凝固為固體。
表3-1瓊脂與明膠特性比較
（二）實驗材料
1．藥品：牛肉膏、蛋白腖、氯化鈉、瓊脂；馬鈴薯，蔗糖；可溶性澱粉、k2hpo4、
kn03，mgs04·7h20、feso4·7h20、等。
2．高壓蒸汽滅菌器、恆溫乾熱滅菌箱、細菌過濾器、紫外線殺菌。
3．其它：天平、牛角匙、電爐、1n hcl、1n naoh、ph試紙、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、帶玻璃珠的三角瓶、帶棉塞的無菌試管、無棉塞的空試管、培養皿、吸管、各種包裝紙、防水紙、繩索、棉花、標籤等。
三、實驗方法與步驟：
(一)、培養基的配置
1．培養基的配製常用方法和步驟：
(1)稱量：按照培養基配方，正確稱取各種原料放於搪瓷杯中。
(2)溶化：在搪瓷杯中加入所需水量(根據實驗需要加入蒸餾水或自來水)，用玻棒攪勻，加熱溶解。
(3)調ph值(調ph也可以在加瓊脂後再調)，用1n naoh或1n hcl調ph，用ph試紙對照。
(4)加瓊脂熔化，在瓊脂熔化過程中，需不斷攪拌，並控制火力不要使培養基溢位或燒焦，待完全熔化後，補足所失水分，一般數量少，時間短不必補水。
(5)分裝：在漏斗架上分裝。根據不同的需要進行分裝，一般制斜面的裝量為管高的五分之一。
特別注意不要使培養基粘汙在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起汙染。
(6)包紮成綑、掛上標籤。培養基分裝好後，塞上棉塞，用防水紙包紮成綑，掛上所配培養基名稱的標籤。
(7)滅菌備用。滅菌後如需製成斜面的，應在下磅後取出，擺成斜面，(見圖3一1)。培養基經滅菌後，必須放在37℃恆溫培養箱中培養24小時，如確無菌生長，方可使用。
2．三種培養基的配方及配製
（1）.牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基(用於分離和培養細菌，是一種天然培養基)。
配方： 牛肉膏 3克
蛋白腖 5克
氯化鈉 3克
瓊脂 20克
自來水 1000毫公升
ph 7．2～7．4
滅菌 15磅／英吋2，30分鐘。
本實驗將原配方配成各種濃縮液。各種濃度如下：30％牛肉膏、50％蛋白腖，30％氯化鈉。以配製200毫公升培養基為例：
吸取30％牛肉膏2毫公升，50％蛋白腖2毫公升，30％氯化鈉2毫公升，加入有刻度的搪瓷燒杯中，然後用自來水補足到200毫公升。用玻捧攪勻，在電爐上稍加熱，調ph至7.4，加瓊脂4克，加熱熔化，用玻棒不斷攪拌，至瓊脂完全溶解為止，趁熱在漏斗架上裝試管，(見圖3—2)。
裝帶有棉塞的無菌試管，裝置五分之一的試管高度共12支，作斜面培養基。用鋁殼試管帽的各裝10毫公升，約試管高度的二分之一以上，用作分離時倒平板用。
分裝完畢，以12支為一捆，用防水紙包紮成綑，(圖3—3)掛上標籤，滅菌備用。
（2）．馬鈴薯(或豆芽汁)蔗糖(或葡萄糖)瓊脂培養基。(用於分離和培養真菌之用，是一種半合成培養基)。
配方：去皮馬鈴薯(或鮮豆芽) 200克
蔗糖(或葡萄糖) 20克
自來水1000毫公升
瓊脂20克
ph自然
滅菌：(含蔗糖)15磅／英吋2 30分鐘。
含葡萄糖)10磅／英吋220分鐘。
製備方法：配製200毫公升培養基。
取去皮馬鈴薯40克，切成小塊，放入無刻度的搪瓷杯中，加水200毫公升，置電爐上加熱，煮沸十分鐘，用四層紗布過濾至具刻度的搪瓷杯中，濾液加水補足至200毫公升，然後加蔗糖4克，加瓊脂4克，加熱熔化，並用玻棒不斷攪拌，直至瓊脂完全熔化，分裝試管，下面一系例步驟同配細菌培養基相同。
（3） 澱粉瓊脂培養基(高氏一號gause』s1)，用於分離和培養放線菌之用，是一種合成培養基。
配方：可溶性澱粉 克
kn031.0克
k2hp04 o.5克
mgs04·7h20 o.5克
nacl o.5克
fes04·7h20， o.01克
瓊脂 20克
自來水 1000毫公升
滅菌：15磅／英吋2，30分鐘。
製備方法：配製200毫公升培養基
吸取配方液：1％ kn03 20毫公升；l％ k2hp04 lo毫公升；l％ mgso4·7h2o lo毫公升；l％nacl 10毫公升；1％feso4·7h2o o.2毫公升，加水補足至200毫公升，置電爐上加熱。
用另乙隻搪瓷杯稱取可溶性澱粉4克，從200毫公升中取出少量加入澱粉中，用玻棒調成糊狀，待液體沸騰後，將澱粉糊洗入培養液中，攪勻，取下調ph至7.4，加瓊脂4克，加熱至瓊脂完全熔化為止，趁熱分裝試管，下面一系例步驟同於配製細菌培養基的操作方法。
（4）．無菌水的製備：
無菌水，為下一次微生物分離實驗中所需用的材料。
100毫公升三角瓶(裝有玻璃珠)，裝自來水45毫公升，試管中裝9毫公升自來水，塞上棉塞，包紮、滅菌備用。三角瓶和試管須預先塞好棉塞，並經乾熱滅菌。
(二)分離培養微生物常用器皿的準備
1．清洗一些玻璃儀器：如三角瓶，試管，培養皿、吸管等。
2．棉塞的製作：裝培養基和分離培養需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞。棉塞的作用為過濾空氣，使試管內外空氣可以流通，但外界空氣中雜菌不能進入，避免汙染。
試管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口約l～2公釐處，用解剖針塞入少許棉花，(約1—1.5厘公尺長)，以防止細菌吸入口中，並避免將口中細菌吹入管內。
棉花要塞得鬆緊適宜。吹時以能通氣但不使棉花滑下為準。
教師示範做試管棉塞，同學每人做5支試管棉塞。棉塞要求不緊不鬆，兩頭光滑，試管棉塞的長度約3厘公尺左右。塞入試管內部分約佔2／3，頭部稍大約佔l/3左右，見圖3—4。
12345 .
圖3-4 棉塞的要求條件
1.正確的式樣 2.管內部太短，管外太鬆 3.管外太小 4.整個棉塞過松 5. 管內部太緊，管外太鬆
3．包裝培養皿和吸管等。為了使培養皿、吸管，三角玻棒等洗淨，乾熱滅菌後，不讓表面暴露，以保證無菌狀態，為此乾熱滅菌前先用舊報紙包裝妥當(見示範)，每組同學包培養皿6只(一包)。
吸管的包裝，將塞好棉花的吸管尖端，放在4～5厘公尺寬的長紙條的一端，約成45角，摺疊紙條，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉，以螺旋式包紮起來。上端剩餘紙條，摺疊打結，準備滅菌。見圖3—5。
(三)培養基和玻璃器材的滅菌方法
滅菌的方法，通常可以分為四大類：(1)加熱滅菌：包括直接灼燒滅菌、乾熱滅菌、加壓蒸汽滅菌、間歇滅菌和煮沸消毒；(2)過濾去菌；（3）射線滅菌和消毒；(4)化學藥劑滅菌和消毒。
在本實驗中，以介紹與培養基和玻璃器材滅菌有關的部份滅菌方法。
1．乾熱滅菌法(即熱空氣滅菌法)：
乾熱滅菌—般是利用電熱烘箱作為乾熱滅菌器。前面所包裝好的玻璃器皿，如帶棉塞的三角瓶，試管、包裝好的吸管、培養皿等
，放入電熱烘箱中。
開啟烘箱頂部的通氣孔，接上電源加熱，使箱內空氣的溫度達到160℃一170℃，關閉通氣孔，使箱內的溫度保持在160℃左右，並維持1.5—2小時。時間一到，切斷電源。
待溫度下降至60一70℃以下，方可開啟箱門取滅菌物品，否則驟冷後易使箱內玻璃儀器破損。
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