微生物學實驗技術教學大綱
課程編號：
課程中英文名稱：微生物學實驗技術
授課教師及職稱： 李增波
開課院系、教研室/研究室：
授課物件：
課程類別：選修課
學時：20
學分：2.0
預修課程/相關知識要求：微生物學
授課目的及內容簡介：
微生物學實驗課是與微生物學理論課同學期開設的一門重要的技術基礎課。通過本課程的教學，使學生較熟練的掌握微生物學實驗的基本操作技術和初步掌握研究微生物的基本方法。通過對具體微生物材料的觀察、分析，進一步加深和鞏固對微生物學理論課所學知識的理解並提高學生分析和解決實際問題的能力。
本課程的基本內容：
1. 掌握顯微鏡的構造、使用技術及保養方法；
2. 掌握乾熱滅菌箱、高壓蒸汽滅菌鍋、恆溫培養箱的使用；
3. 掌握基本染色原理和方法以及製片技術；
4. 掌握細菌、酵母菌、黴菌的基本形態結構、生理生化特徵和血清學特性，具有菌種初步鑑定的基本技能；
5. 掌握無菌操作方法，熟悉微生物分離、篩選和育種的基本知識和技能；
6. 熟悉菌種保藏的一般方法。
教材及主要參考書目及文獻：
1. 杜連祥，路福平主編。《微生物學實驗技術》，中國輕工業出版社，2005，8.
2. 杜連祥等主編。《工業微生物實驗技術》，天津市科學技術出版社，1992，10.
主要內容與安排：
實驗一學習顯微鏡的結構及使用
實驗二培養基的製備與滅菌
實驗四細菌的莢膜染色
實驗五放線菌和真菌形態觀察
實驗六微生物細胞大小測定和微生物顯微鏡直接計數法
實驗七土壤中微生物的稀釋分離、純化及無菌操作技術
實驗八生素效價的生物測定
微生物綜合實驗檸檬酸發酵及提取
實驗一學顯微鏡的結構及使用
一、實驗目的：
人的眼睛只能識別大小為0.1㎜的物體。顯微鏡是精密的放大儀器，是生物學研究不可缺少的工具。
我們用它可以觀察肉眼看不見的微小生物的結構。中學最常用的是光學顯微鏡，為了正確操作、妥善保管和維護顯微鏡，使之延長使用年限，我們必須首先了解顯微鏡的結構和功能。
1、了解普通光學顯微鏡的基本構造，能夠規範和較熟練地使用。
2、了解幾種特殊光學顯微鏡的構造、工作原理和用途。
二顯微鏡的結構：
一台顯微鏡包括機械裝置和光學系統兩大部分，注意比較和識別。
1.機械部分
（1）鏡筒為顯微鏡上部圓形中空的長筒，筒口上端安裝目鏡，下端與物鏡轉換器相連。作用是保護成像的光路與亮度。
（2）轉換器固著在鏡筒下端，分兩層，上層固著不動，下層可自由轉動。轉換器上有2～4個圓孔，用來安裝不同倍數的低倍或高倍物鏡。
（3）粗準焦螺旋位於鏡臂的上方，可以轉動，以使鏡筒能上下移動，從而調節焦距。
（4）細準焦螺旋位於鏡臂的下方，它的移動範圍較粗準焦螺旋小，可以細調焦距。
（5）鏡座是位於鏡臂的下方，顯微鏡的底部，呈馬蹄形的金屬座。用以穩固和支援鏡身。
（6）鏡柱從鏡座向上直立的短柱。上連鏡臂，下連鏡座，可以支援鏡臂和載物台。）
（7)傾斜關節鏡柱和鏡臂交界處有乙個能活動的關節。它可以使顯微鏡在一定的範圍內後傾（一般傾斜不得超過45°）便於觀察。但是在使用臨時封片觀察時，禁止使用傾斜關節，尤其是裝片內含酸性試劑時嚴禁使用，以免汙損鏡體。
（8)載物台從鏡臂向前方伸出的金屬平台。呈方形或圓形，是放置玻片標本的地方。其**具有通光孔，在通光孔的左右有乙個彈性的金屬壓片夾，用來壓住載玻片。
較高階的顯微鏡，在載物台上常具有推進器，它包括夾片夾和推進螺旋，除夾住切片外，還可使切片在載物台上移動。
2.光學部分
（1)目鏡它是安裝在鏡筒上端的鏡頭。是由一組透鏡組成的，它可以使物鏡成倍地分辨、放大物像，例如 5×、10×、15×、20×。
（2)物鏡是決定顯微鏡質量的關鍵部件。安裝在轉換器的孔上，也是由一組透鏡組成的，能夠把物體清晰地放大。一般有三個放大倍數不同的物鏡，即：
低倍物鏡 （8×或10×）、高倍物鏡（40×或45×）和油浸物鏡（90×或100×），根據需要可選擇乙個使用。顯微鏡的放大倍數是目鏡倍數乘以物鏡的倍數。
（3)反光鏡在聚光器的下面有乙個一面平另一面凹的雙面圓鏡。可作各種方向的翻轉，光線較強時使用平面鏡，反之使用凹面鏡。
（4)聚光器 （學生用顯微鏡一般沒有這個裝置）是由凹透鏡組成的，它可以集中反光鏡投射來的光線。在鏡柱前面有乙個聚光器調節螺旋，它可以使聚光器公升降，用以調節光線的強弱，下降時明亮度降低，上公升時明亮度加強。
（5)虹彩光圈又稱可變光闌，由多數金屬片組成（學生用顯微鏡一般沒有這個裝置），在較高階的顯微鏡上具有此裝置。使用時移動其把柄，可控制聚光器透鏡的通光範圍，用以調節光的強度。虹彩光圈下常附有金屬圈，其上裝有濾光片，可調節光源的色調。
（6)遮光器簡單的顯微鏡無聚光器和虹彩光圈，而裝有遮光器。遮光器呈圓盤狀，上面有大小不等的圓孔（光圈）。光圈對準通光孔，可以調節光線的強弱。3.顯微鏡的成像原理（放大原理）
光線→反光鏡→遮光器→通光孔→標本（一定要透明）→物鏡的透鏡（第一次放大成倒立實像）→鏡筒→目鏡（再放大成虛像）→眼。
三、顯微鏡的使用方法
（1）取鏡安放
取鏡右手握住鏡臂，左手平托鏡座，保持鏡體直立。（特別要禁止單手提著顯微鏡走，防止目鏡從鏡筒中滑脫）。
安放放置桌邊時動作要輕。一般應在身體的前面，略偏左，鏡筒向前，鏡臂向後，距桌邊7～10 ㎝處，以便觀察和防止掉落。安放目鏡和物鏡。
（2）對光
轉動轉換器，使低倍物鏡正對通光孔。左眼注視目鏡內，右眼同時睜開，用手轉動反光鏡，面向光源。在目鏡裡看見乙個圓形、明亮的視野（一定要用非直射光）。把乙個較大的光圈對準通光孔。
（3）低倍鏡的使用
觀察任何標本都必須先用低倍鏡。
①放置切片公升高鏡筒，把玻片標本放在載物台**，標本材料正對通光孔的中心，用壓片夾壓住載玻片的兩端。
②調焦兩眼從側面注視物鏡，轉動粗準焦螺旋，讓鏡筒徐徐下降，至物鏡距玻片2～5 ㎜處。然後用左眼注視目鏡，右眼同時睜開，（以便繪圖），同時用手反方向（逆時針方向）轉動粗準焦螺旋，使鏡筒緩緩上公升，直到看清物像為止。如果不夠清楚，可用細準焦螺旋調節。
（不可以在調焦時邊觀察邊使鏡筒下降，以免壓碎裝片和鏡頭。
③低倍鏡的觀察由所用的目鏡放大倍數與物鏡放大倍數相乘，即為原物被放大的倍數。如果物像不在視野**，要慢慢移動到視野**，適當再進行調節。
4）高倍鏡的使用
①選好目標先用低倍物鏡確定要觀察的目標，將其移至視野**。轉動轉換器，把低倍物鏡輕輕移開，原位置小心換上高倍物鏡。（用高倍物鏡工作距離較短，操作要十分仔細，以防鏡頭碰擊玻片）。
②調焦在正常情況下，當高倍物鏡轉正之後，在視野**即可見到模糊的物像，只要向反時針方向略微調動細準焦螺旋，既可獲得清晰的物像。
在換上高倍物鏡觀察時，視野變小變暗，要重新調節視野亮度，可公升高聚光器或利用凹面反光鏡。
（5）油鏡的使用（中學生一般不使用，在這裡不做詳述）
（6）使用後的整理
觀察結束，應先將鏡筒公升高，聚光器下降，再取下切片，然後轉動轉換器，使物鏡與通光孔錯開，做好清潔工作。清潔完畢，再下降鏡筒，使兩個物鏡位於載物台上通光孔的兩側，呈「八」字形，將反光鏡轉至與載物台垂直，罩上防塵罩，仍用右手握住鏡臂，左手平托鏡座，按號放回鏡箱中。
四討論：
1．降低鏡筒時，操作者最關鍵的姿勢應該是什麼？其重要性是什麼？
2．當視野太明亮，光線刺眼時，這樣的光線會使人眼的視網膜永久性損壞。其原因和解決的方法是什麼？
實驗二培養基的製備與滅菌
一、實驗目的
（1） 熟悉玻璃器皿的洗滌包裝和滅菌前的準備工作。
（2） 學習微生物培養基和無菌水的製備，了解培養基配方中各成分的作用、製備流程及各環節的操作技術與應用。
（3） 學習並掌握培養基的高壓蒸氣滅菌原理、操作關鍵技術和滅菌技術。
二、實驗原理
培養基的製備原理：
培養基是按照微生物生長發育的需要，用不同組分的營養物質調製而成的營養基質。人工製備培養基的目的，在於給微生物創造乙個良好的營養條件。把一定的培養基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環境和場所。
自然界中，微生物種類繁多，由於微生物具有不同的營養型別，對營養物質的要求也各不相同，加之實驗和研究上的目的不同，所以培養基在組成原料上也各有差異。但是，不同種類和不同組成的培養基中，均應含有滿足微生物生長發育的水分、碳源、氮源、無機鹽和生長素以及某些特需的微量元素等。此外，培養基還應具有適宜的酸鹼度(ph值)和一定緩衝能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。
根據製備培養基對所選用的營養物質的**，可將培養基分為天然培養基、半合成培養基和合成培養基三類。按照培養基的形態可將培養基分為液體培養基和固體培養基。根據培養基使用目的，可將培養基分為選擇培養基、加富培養基及鑑別培養基等。
培養基的型別和種類是多種多樣的，必須根據不同的微生物和不同的目的進行選擇配製，本實驗分別配製常用培養細菌、放線菌和真菌的牛肉膏蛋白腖培養基、高氏一號合成培養基和馬鈴薯蔗糖培養基等固體培養基。
固體培養基是在液體培養基中新增凝固劑製成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和矽酸鈉，其中以瓊脂最為常用，其主要成份為多醣類物質，性質較穩定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學成份變化。瓊脂在95℃的熱水中才開始融化，融化後的瓊脂冷卻到45℃才重新凝固。因此用瓊脂製成的固體培養基在一般微生物的培養溫度範圍內(25℃-37℃)不會融化而保持固體狀態。
高壓蒸氣滅菌原理：
高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在乙個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然後關閉排氣閥，繼續加熱，此時由於蒸汽不能溢位，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高於100℃的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。
表ⅴ-2 蛋白質含水量與凝固所需溫度的關係
表ⅴ-3 乾熱與濕熱穿透力及滅菌效果比較
在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比乾熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低(表ⅴ-2)，二是濕熱的穿透力比乾熱大(表ⅴ-3)；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時，由氣態變為液態時可放出2.26kj(千焦)的熱量。
這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。
在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣膨脹壓大於水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低於飽和蒸汽的溫度。滅菌鍋內留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關係見表ⅴ-4。一般培養基用1.
05kg/cm2，121.3℃ 15-30分鐘可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體情況而有所改變。
例如含糖培養基用0.56kg/cm2(8磅/英吋2)，112.6℃滅菌15分鐘，但為了保證效果，可將其他成分先行121.
3℃，20分鐘滅菌，然後以無菌操作手續加入滅菌的糖溶液。又如盛於試管內的培養基以1.05kg/cm2，121.
3℃滅菌20分鐘即可，而盛於大瓶內的培養基最好以1.05kg/cm2滅菌30分鐘。
微生物學實驗指導
懷化學院微生物學課程組 一 課程性質 地位和作用 微生物學實驗是製藥工程專業的微生物學課程內實驗，為了配合微生物學的教學而開設的。我們將微生物學實驗專案按微生物學研究和生產實踐程式而構建成乙個綜合性整體。在這個綜合性系統中，包含了要掌握的各項微生物學技術。實驗專案保分為驗證性實驗部分 綜合性實驗部分...
微生物學複習
微生物學中的一些問題 第2章純培養 1.冷凍真空乾燥保藏 液氮保藏法是目前使用最普遍 最重要的微生物保藏方法，大多數專業的菌種保藏機構均採用這兩種方法作為主要的微生物儲存手段。t 2.如果要從環境中分離得到能利用對氨基苯乙酸 以2，4 d作為唯一碳源和能源的微生物純培養物，你該如何設計實驗？從對氨基...
微生物學提綱
微生物學 提綱及思考題 1.什麼是微生物?它包括哪些類群?答 微生物是一切肉眼看不見或看不清的微小生物的總稱.包括 原核類的細菌 放線菌 藍細菌 支原體 立克次氏體和衣原體 真核類的真菌 原生動物 和顯微 藻類,以及屬於非細胞類的病毒和亞病毒.2.微生物有哪五大共性？其中最基本的是哪乙個？為什麼？答...