目錄實驗一環境中微生物的檢測 1
實驗二細菌的革蘭氏染色 3
實驗三細菌的芽孢染色 5
實驗四黴菌水浸標本片的製備與觀察 7
實驗五牛奶中菌落總數的測定技術 8
實驗六食品中金黃色葡萄球菌的測定 11
實驗七國標法測定食品中的大腸菌群 14
附錄1 大腸菌群最可能數（mpn）檢索表 16
一、實驗目的
1．學習環境中微生物的檢測方法。
2．比較來自不同場所與不同條件下細菌的數量和型別。
二、實驗原理
自然環境中普遍存在著各種各樣的微生物，檢測微生物的存在，簡單的方法是應用一般營養瓊脂，使微生物細胞或其孢子落到營養瓊脂表面，在適宜溫度下即可大量繁殖，形成肉眼可見的群體——菌落。不同微生物各自具有不同的菌落形態。
三、實驗儀器與材料
1．培養基：
營養瓊脂平板（na）：
成分：蛋白腖10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂17g，蒸餾水1000ml，ph7.2。
制法：將除瓊脂外的各成分溶解於蒸餾水中，校正ph，加入瓊脂，分裝於燒瓶內，121℃，15min高壓滅菌備用。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板（pda）：
成分：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖（或蔗糖）20g，瓊脂20g，水1000ml。
制法：ph值自然。將馬鈴薯去皮、洗淨、切成小塊，稱取200g加入1000ml蒸餾水，煮沸20min，用紗布過濾，濾液補足水至1000ml，再加入糖和瓊脂，溶化後分裝，121℃滅菌20min。
另外，用少量乙醇溶解0.1g氯黴素，加入1000ml培養基中，分裝滅菌後可用於食品中黴菌和酵母菌計數、分離。
2．儀器用具：恆溫培養箱、記號筆
四、實驗步驟
1、取營養瓊脂、pda平板各乙個，在皿蓋上用記號筆標明班級、姓名及編號。
2、分別開啟皿蓋，做如下處理：
（1）置實驗台上，於空氣中暴露5分鐘。
（2）置地面上，腳擊地板，於振動的空氣中暴露5分鐘。
（3）用自己的手指分別觸控平板（輕按即可）。
（4）呼出氣體於平板上。
3、把經以上處理的平板分別蓋上皿蓋，將培養皿倒置於恆溫培養箱內培養，營養瓊脂平板置於37℃培養箱中培養48h，pda平板置於28℃培養箱中培養2-3天後檢查結果。
五、思考題
觀察平板上有無微生物群體——菌落出現，並比較不同微生物種類所形成的菌落在形態上的差別。若pda平板出現菌落較少或尚未長出時，置28℃恆溫下繼續培養2天觀察。
（1）觀察na、pda平板上微生物的顏色、透明度、光澤度、形態、凸起。
（2）比較na、pda平板上微生物的種類、數量。
（3）分別計算不同平板及不同處理下各平板上出現的菌落數。
一、實驗目的
1. 學習並初步掌握革蘭氏染色法。
2. 了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑑定中的重要性。
二、實驗原理
革蘭氏染色法是細菌學中最重要的鑑別染色法。由於革蘭氏陽性菌細胞壁含肽聚醣多、脂類少，且是緊密的立體網狀結構，用乙醇洗脫不出染料，故為藍紫色；革蘭氏陰性菌細胞壁含肽聚醣少、脂類多，且呈疏鬆的片層結構，乙醇使脂類溶解將染料洗脫，因此可被復染而呈現紅色。
三、實驗儀器與材料
1. 菌種: 牛肉膏蛋白腖瓊脂培養18～20h的枯草芽孢桿菌、牛肉膏蛋白腖瓊脂培養24 h的大腸埃希氏菌
2. 試劑: 草酸銨結晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、番紅染色液
草酸銨結晶紫染色液：將2.5g結晶紫研細後，加入25ml 95%酒精使之溶解，配成a液，將1.0g草酸銨溶於100ml蒸餾水配成b液，兩液混合即成。
路哥氏碘液：碘1.0g、碘化鉀2.0g、蒸餾水300.0ml。先將碘化鉀溶解在一小部分的蒸餾水中，再將碘溶解在碘化鉀溶液中，然後加入其餘的蒸餾水即成。
番紅染色液：番紅2.0g，蒸餾水100.0ml。用蒸餾水溶解即成2%番紅染色液。
3. 儀器或其它用具: 顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環、雙層瓶（內裝香柏油和二甲苯）、擦鏡紙、吸水紙、生理鹽水等。
四、實驗步驟
1、塗片：取一塊乾淨的載玻片，並在其**滴一小滴生理鹽水。接種環在酒精燈上殺菌後從斜面挑取少量菌種與玻片上的水滴混勻後並塗佈成一均勻的薄層。塗佈面一般以直徑1cm大小範圍為宜。
2、乾燥：自然晾乾或在火焰上烘乾。
3、固定：置於酒精燈火焰上加熱固定（迅速通過火焰三次）。
4、染色
⑴初染：將結晶紫滴於塗片上染色1min，用蒸餾水沖洗。
⑵媒染：滴加路哥氏碘液，媒染1min，用蒸餾水沖洗。
⑶脫色：用95%乙醇邊滴邊洗25s，或在塗片處加1～2滴95%酒精浸泡25s後，立即用水沖洗。
⑷復染：用1～2滴番紅復染2min，用蒸餾水沖洗。
5、乾燥：用吸水紙將多餘的水分吸乾。
6、鏡檢：先低倍鏡，後高倍鏡，最後用油鏡觀察。
五、實驗結果
將觀察結果記入下表
六、思考題
1、革蘭氏染色法成敗的關鍵是什麼？為什麼？
2、革蘭氏染色應選用何種菌齡的細菌？為什麼？
一、實驗目的
學習並初步掌握細菌的芽孢染色法，觀察芽孢細菌的形態特徵。
二、實驗原理
細菌的芽孢具有厚而緻密的壁，透性低，不易著色，用一般染色法僅能使菌體著色，芽孢呈透明的輪廓。但是芽孢一旦著色後，脫色也比較困難，因此，所有芽孢染色法都基於同一原則：除了採用著色力強的染料外，還需要在加熱情況下操作，以促進標本著色，然後使菌體脫色，而芽孢上的染料仍然保留。
經復染後，菌體和芽孢即分別呈現不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽孢，便於觀察。
三、實驗儀器與材料
1、菌種: 牛肉膏蛋白腖瓊脂斜面上培養24～36小時的枯草芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌
2、試劑: 孔雀綠染色液、番紅染色液
孔雀綠染色液：孔雀綠5.0g、蒸餾水100.0ml。用蒸餾水溶解即成5%孔雀綠染色液。
3、儀器或其它用具: 顯微鏡、酒精燈、沸水浴、小試管、試管夾、洗瓶及廢液缸、載玻片、接種環、雙層瓶（內裝香柏油和二甲苯）、擦鏡紙、生理鹽水等。
四、實驗步驟
孔雀綠-番紅染色法（schaeffer—fulton改良染色法）：
1、制菌液：取一支小試管，加蒸餾水1～2滴，用接種環從斜面上挑取芽孢桿菌2～3環，混於試管蒸餾水中，充分打勻，使成均勻而濃稠的菌液。
2、加染料：加約2～3滴的孔雀綠染色液於小試管中，搖勻。
3、加熱染色：將試管置於沸水浴中加熱15～20分鐘。
4、制塗片：用接種環取加熱後的染色菌液於潔淨的載玻片上，塗成薄膜，乾燥後於酒精燈火焰上固定。
5、脫色：用緩流水洗至無綠色流出。
6、復染：甩去玻片上多餘的水分，滴加番紅染色液1～2滴，復染5分鐘後傾去染液，水洗，用吸水紙吸乾，充分乾燥。
7、鏡檢：先低倍鏡，後高倍鏡，最後用油鏡觀察。
五、實驗結果
將芽孢染色觀察結果記入下表：
六、思考題
在芽孢染色過程中，為什麼要加熱？
實驗四黴菌水浸標本片的製備與觀察
一、實驗目的
1．學習並掌握自製水浸片並觀察黴菌的形態。
2．了解三類常見黴菌的基本形態特徵。
二、實驗原理
黴菌的的營養體是分枝的絲狀體，分為基內菌絲和氣生菌絲。氣生菌絲又可分化出繁殖菌絲，不同黴菌的繁殖菌絲可形成不同的孢子。黴菌菌絲體及孢子的形態特徵是識別不同種類黴菌的重要依據。
黴菌菌絲粗大，通常為細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。但黴菌細胞易收縮變形，且孢子容易飛散，故制標本時常用乳酸石炭酸棉藍染色液。此染色液製成的黴菌標本片的特點是：
細胞不變形，具有殺菌防腐作用，且不易乾燥，能保持較長時間，溶液本身呈藍色，有一定染色效果。
三、實驗儀器與材料
1、菌種：用馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養2～5天的黑麴黴、青黴、根黴
2、試劑：乳酸石炭酸棉藍染色液、50%乙醇
乳酸石炭酸棉藍染色液：石炭酸10.0g、乳酸（相對密度1.
21）10.0ml、甘油20.0ml、蒸餾水10.
0ml、棉藍0.02g。將石炭酸加在蒸餾水中加熱溶化，加入乳酸和甘油，最後加入棉藍即成。
3、儀器或其它用具：顯微鏡、接種環、載玻片、蓋玻片、蒸餾水、酒精燈、無菌平皿等。
四、實驗步驟
1、制水浸標本片
在載玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉藍染色液，用接種環從生長有黴菌的平板中挑取少量帶有孢子的黴菌菌絲，用50%的乙醇浸潤，再用蒸餾水將浸過的菌絲洗一下，然後放入載玻片上的液滴中，仔細地用接種針將菌絲分散開來（注意不要塗），蓋上蓋玻片。
2、先用低倍鏡觀察，必要時轉換高倍鏡觀察，記錄觀察結果。
五、實驗結果
繪出不同黴菌自然生長的形態圖，並註明各部位的名稱。
六、思考題
描述一下各種黴菌在pda平板上的菌落特徵。
菌落的形態（絨毛狀、蜘蛛網狀、棉絮狀）、光滑（粗糙）、濕潤（乾燥）、質地緊密（疏鬆）、是否透明、是否容易挑取、菌落的顏色、菌落正反面及**與邊緣的顏色是否一致。
一、實驗目的
學習和掌握平板活菌計數法的基本原理和方法。
二、實驗原理
菌落總數是指食品經過處理，在一定條件下培養後，所得1g或1ml檢樣中所含細菌菌落總數，主要作為判別食品被汙染程度的標誌。
菌落總數測定最常用的方法是平板活菌計數法，即將待測樣品經適當稀釋後，製成均勻的一系列不同稀釋度的稀釋液，取一定量的稀釋液和適量的培養基於平板中混勻，經培養後，平板上出現單一菌落，即為乙個菌落形成單位（cfu），根據平板上長出的菌落數，計算每g（ml）樣品中的含菌數。
三、實驗器材
1、檢樣：鮮牛奶
2、培養基：牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基，無菌生理鹽水
3、儀器用具：恆溫培養箱（37℃）、恆溫水浴鍋、酒精燈、試管（18*180mm）、試管架、無菌培養皿、無菌移液管（10ml和1ml）、電爐、ph試紙（ph 5.5～9.
0）、錐形瓶（300ml和500ml）、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、酒精棉球、打火機等。
四、實驗步驟
1、取樣：以無菌操作取樣。
2、樣品的稀釋：以無菌操作吸取檢樣25 ml，放於盛有225ml滅菌生理鹽水的三角瓶中，振搖10min，製成1:10的均勻稀釋液。
取1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管中，振搖混勻，製成1:100的稀釋液。
另取1ml滅菌吸管，按上述操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml吸管。根據樣品情況，做成 10-3、10-4、10-5稀釋液。
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