待測樣品中微生物的分離、培養和鑑定及菌落特徵觀察
1、實習目的
1、掌握待測樣品中各種微生物的分離成純種；
2、掌握真菌、細菌的菌落特徵，細菌革蘭氏染色法、真菌水玻片的製作方法。
2、實習原理
微生物具有個體微小的特徵，對於微生物可以說是無處不在，同時微生物也是物種最豐富的生物類群。微生物廣泛存在土壤、空氣和各種自然狀態的水中。我們可以從土壤、空氣、水中分離得到各種各樣的微生物，如細菌、真菌和放線菌，在不同的培養基額培養溫度就可分離得到。
真菌一般具有豐富的菌絲有的氣生菌絲發達，有的氣生菌絲和營養菌絲發達，真菌菌絲較粗而長，菌落表面乾燥，如黴菌。細菌菌落一般呈現出濕潤、較光滑、較透明、較粘稠、易挑取、菌落正反面顏色相近。
細菌的細胞壁有肽聚醣構成，有的細菌細胞壁的肽聚醣層多達50多層，用革蘭氏染色法染色後菌體細胞呈現紫色，另外一些細菌則是僅有幾層肽聚醣層，革蘭氏染色法染色後菌體呈現紅色。革蘭氏染色法是細菌中常用的染色方法。其機制是：
通過結晶紫初染和碘液媒染後，可在細菌的細胞壁內形成不溶於水的結晶紫碘複合物。革蘭氏陽性細菌的細胞壁肽聚醣厚且交聯程度高，在用乙醇脫色時複合物不會流出細胞壁，細胞始終保持紫色，而革蘭氏陰性細菌的細胞壁肽聚醣層薄交聯程度低，而且脂類物質含量高，在用乙醇脫色時，脂類物質會被溶解複合物流出，用番紅染液染色後菌體細胞呈現出紅色。因此用革蘭氏染色法可將細菌分為革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌兩類。
3、實習方法
1、實驗材料
採取東二院的植被下的土壤。
2、培養基
馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（pda培養基）、牛肉膏蛋白腖培養基
3、實驗過程
3.1 按照培養基配方配製培養基，配製好的培養基高溫高壓滅菌30min。
pda培養基：去皮馬鈴薯200g，蔗糖或葡糖糖20g、瓊脂15—20g，蒸餾水1000ml；
牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基：牛肉膏5.0g，蛋白腖10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15—20g，蒸餾水1000ml，ph7.4。
3.2 土壤處理
將土壤放入潔淨的研缽中輕慢磨細，再用細篩子濾去較大的顆粒。稱取5g土壤置於45ml無菌水中搖勻靜置片刻。將土壤磨細是為了使土壤中的微生物從土壤中盡量完全釋放出來。
3.3 平板塗佈
在無菌環境下向無菌試管中取9ml無菌水，從稀釋好的樣品中吸取1ml上清懸浮液放入9ml無菌水中再稀釋。此時土樣總共稀釋了100倍。從試管中取200 ul樣液於牛肉膏蛋白腖培養基和pda培養基中。
用三角塗佈棒塗勻，置於30℃下培養一段時間。
3.4 細菌和真菌形態的觀察
細菌形態採用革蘭氏染色法對細菌染色，真菌製作水玻片觀察其菌絲形態。製作細菌塗片。先在載玻片上滴上一滴無菌水用接種環挑適量的細菌在無菌水上，在酒精燈附近將玻片烤乾（玻片不能太熱否則烤死細菌），已到達固定的目的。
固定好的玻片就可以進行革蘭氏染色。先用結晶紫初染1min水洗，盧戈氏碘液媒染1min水洗，酒精脫色，番紅復染1min水洗。蓋上蓋上蓋玻片顯微鏡下觀察染色結果。
製作真菌水玻片。同樣在載玻片上滴一滴無菌水，用接種環挑適量的真菌菌落在無菌水上，蓋上蓋玻片並輕壓蓋玻片。顯微鏡下鏡檢，觀察真菌菌絲形態。
4、實習結果及討論
1、牛肉膏蛋白腖培養基上的細菌菌落和pda培養基上的真菌菌落；細菌菌落小而濕潤，菌落幾乎透明；真菌菌落四周有絲狀結構。
牛肉膏蛋白腖培養基上的細菌
2、革蘭氏染色後的細菌形態如下圖
桿狀的革蘭氏陽性細菌
革蘭氏陰性細菌
3、真菌菌絲的觀察
4、細菌和真菌菌落
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