（懷化學院微生物學課程組）
一、課程性質、地位和作用
微生物學實驗是製藥工程專業的微生物學課程內實驗，為了配合微生物學的教學而開設的。我們將微生物學實驗專案按微生物學研究和生產實踐程式而構建成乙個綜合性整體。在這個綜合性系統中，包含了要掌握的各項微生物學技術。
實驗專案保分為驗證性實驗部分、綜合性實驗部分、設計性實驗部分和研究性實驗部分。我們希望通過本實驗的教學，培養學生掌握微生物學基本操作技能，具備較強的觀察、思考、分析問題的能力，能解決製藥工程領域中微生物學研究和生產領域實際問題的基本能力；養成實事求是、嚴肅認真的科學態度以及勤儉節約、愛護公物的良好作風。
二、考核方法與要求
1．平時成績：包括出勤、實驗操作，實驗效果、討論情況等，佔30%
2．報告成績：實驗報告等，佔20%
3．考試成績：實驗操作考試，20%；理論考試，30%
4．綜合考核成績：平時成績+設計成績+報告成績+考試成績
實驗一培養基的製備與滅菌
一、實驗目的
1．掌握培養基配製的原理。
2．通過對牛肉膏蛋白腖培養基、高氏一號培養基、 馬鈴薯培養基的配製，掌握配製培養基的一般方法和步驟。
3．了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及操作方法。
二、實驗原理
1．什麼是培養基，一般培養基應具備哪些營養要素？
2．培養基有哪些型別，為什麼培養不同的微生物需要的培養基不同，培養基為什麼要調節ph 值，配製好的培養基為什麼要立即滅菌？
3．高壓蒸汽滅菌的原理是什麼？
三、實驗材料和用具
牛肉膏、蛋白腖、瓊脂、可溶性澱粉、葡萄糖（或蔗糖）、鏈黴素、1mol/l naoh、1mol/l h cl、k2hpo4·3h2o、mgso4·7h2o、feso4·7h2o 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、ph試紙、棉花、牛皮紙、記號筆、線繩、紗布和玻璃漏斗等。
四、操作步驟
(一 )牛肉膏蛋白腖培養基的配製
牛肉膏蛋白腖培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基。其配方如下:
牛肉膏3g，蛋白腖l0g，nacl 5g，瓊脂15-20g, 水1000ml，ph 7.4—7.6
1. 稱量：按實際用量計算後，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。
牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解後倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨後放人熱水中，牛肉膏便與稱量紙分離，立即取出紙片。蛋白腖極易吸潮，故稱量時要迅速。
2. 加熱溶解：在燒杯中加入少於所需要的水量，然後放在石棉網上，小火加熱，並用玻棒攪拌，待藥品完全溶解後再補充水分至所需量。
若配製固體培養基，則將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，在此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢位，最後補足所失的水分。
3. 調ph：檢測培養基的ph，若ph偏酸，可滴加1mol/l naoh，邊加邊攪拌，並隨時用ph試紙檢測，直至達到所需ph範圍。
若偏鹼，則用1mol/lhcl進行調節。ph的調節通常放在加瓊脂之前。應注意ph值不要調過頭，以免**而影響培養基內各離子的濃度。
4. 過濾：液體培養基可用濾紙過濾，固體培養基可用4層紗布趁熱過濾，以利結果的觀察。但是供一般使用的培養基，此步可省略。
5. 分裝：按實驗要求，可將配製的培養基分裝入試管或三角瓶內。
分裝時可用三角漏斗以免使培養基沾在管口或瓶口上面造成汙染。分裝量：固體培養基約為試管高度的1／5，滅菌後製成斜面。
分裝入三角瓶內以不超過其容積內一半為宜。半固體培養基以試管高度的1/4為宜．滅菌後垂直待凝。
6. 加棉塞：試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)製作的棉塞，棉塞製作方法則圖1－1。
棉塞的形狀、大小和鬆緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利透氣的作用。要使棉塞總長約3／5塞人試管口或瓶口內，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的透氣，則可用8層紗布製成通氣塞。
有時也可用試管帽或塑料蓋代替棉塞。
7. 包紮：加塞後，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。
若培養基分裝於試管中，則應先把試管紮成捆後，再於棉塞外包—層牛皮紙。然後用記號筆註明培養基名稱、組別、日期。
8. 滅菌：將上述培養基於121．3℃濕熱滅菌20min。如因特殊情況沒能及時滅菌，則應放人冰箱內暫時儲存。
9. 擺斜面：滅菌後，如製斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，並調整斜度，使斜面長度不超過試管總長的一半。
10. 無菌檢查。將滅菌的培養基放入37℃溫箱中培養24-48h，無菌生長時可以使用，或放置在冰箱或清潔的櫥內，備用。
圖1-1 棉塞的製作過程
(二)高氏1號培養基的配製
高氏1號培養基是用於分離和培養放線菌的合成培養基。其配方如下：
可溶性澱粉20g，kno31g，nacl 0.5g，k2hpo4·3h2o 0.5g，mgs04·7h2o 0.
5g ，feso4·7h2o 0.01g，瓊脂15—20g, 水1000mi，ph 7.2-7.
4。1. 稱量和溶解：經計算後稱量，按用量先稱取可溶性澱粉，放人小燒杯中，並用少量冷水將其調成糊狀，再加入少於所需水量的沸水中，繼續加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解，再加入其他成分依次溶解。
對微量成分feso4.7h2o可先配成高濃度的貯備液後再加入，方法是先在100ml水中加入1g的feso4.7h2o，配成濃度為0.
01g／ml的貯備液，再在1000ml培養基中加入以上貯備液1ml即可。待所有藥品完全溶解後，補充水分到所需的總體積。如要配製固體培養基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白髒培養基配製。
2. ph調節、分裝、包紮、滅菌及無菌檢查，與牛肉膏蛋白腖培養基配製方法同。
(三)馬鈴薯蔗糖培養基的配製
馬鈴薯培養基是用於分離真菌的選擇培養基。其配方如下：馬鈴薯200g，葡萄糖（或蔗糖）10g，瓊脂15-20g，水1000mi，自然ph。
1. 稱量和溶解。馬鈴薯去皮，切成塊加水，煮沸30min（注意火力的控制，可適當補水），用紗布過濾，濾液加糖，加入瓊脂加熱融化，方法同牛肉膏蛋白腖培養基配製，補足水至所需的總體積。
2. 分裝、包紮、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋自腖培養基配製。
3. 鏈黴素的加入。鏈黴素受熱容易分解，所以臨用時，將培養基融化後待溫度降全45℃左右時才能加入。
可先將鏈黴素配成1％的溶液(配好的鏈黴素溶液儲存於-20℃)，在1000ml培養基中加1％鏈黴素0.3ml，使每毫公升培養基中含鏈黴素30ug。
注意事項:
稱藥品用的牛角匙不要混用；稱完藥品應及時蓋緊瓶蓋：調ph時要小心操作，避免**。
(四)高壓蒸汽滅菌法
高壓蒸汽滅菌法適用於培養基、無菌水、工作服等物品的滅菌。
1. 加水。將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，以水面與三角架相平為宜。
2. 裝料。將裝料桶放回鍋內，裝入待滅菌的物品。裝有培養基的容器放置時要防止液體溢位，瓶塞不要緊貼桶壁，以免冷凝水沾濕棉塞。
3. 加壓。將蓋上與排氣孔相連線的排氣軟管插人內層滅菌桶的排氣槽內，擺正鍋蓋，對齊螺口，然後以同時旋緊相對的兩個螺栓的方式擰緊所有螺栓，並開啟排氣閥。
4. 排氣。用電爐或煤氣加熱，待水煮沸後，水蒸汽和空氣一起從排氣孔排出. 一般排出的氣流很強並有噓聲時，表明鍋內空氣已排淨(沸後約5min)。
5. 公升壓。當鍋內空氣排淨時，即可關閉排氣閥，壓力開始上公升。本實驗用121℃，20min滅菌。
7. 降壓。達到所需滅菌時間後，關閉熱源，讓壓力自然下降到零後，開啟排氣閥，放淨餘下的蒸汽後，再開啟鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內剩水。
8. 無菌檢查將已滅菌培養基於37℃培養24h，無雜菌生長，即可待用。。
五、問題和思考
1. 配製培養基有哪幾個步驟?在操作過程中應注意些什麼問題?為什麼?
2. 培養基配製完成後，為什麼必須立即滅菌?若不能及時滅菌應如何處理？如何進行無菌檢查，
3. 試設計實驗對飲料進行無菌檢查。
實驗二從土壤中分離和純化微生物
一、實驗目的
1．學習從土壤中分離微生物的方法，學習無菌操作技術；
2．掌握微生物樣品稀釋法和塗佈平板法分離微生物的操作技術；
3．初步掌握無菌操作技術和平板菌落計數法。
二、實驗原理
1. 什麼是微生物的純培養，從固體培養基中分離微生物的方法有哪些?
2. 為什麼可以根據菌落數目來計算樣品中微生物的數量?
三、實驗材料和用具
土壤樣品：有目的地取某一型別的土壤。
培養基：已滅菌的牛肉膏、高氏1號、土豆蔗糖固體培養基，90ml無菌水(帶玻璃珠)1瓶、100無菌水、無菌試管、10％酚液、1%鏈黴素。
無菌培養皿12套、5ml和1ml的無菌移液、天平、稱量紙、藥勺、試管架、塗佈器。
四、操作步驟
(一)土壤稀釋分離
1. 取土壤。取表層以下5—10cm處的土樣，放入滅菌的袋中備用，或放在4℃冰箱中暫存。
2. 製備稀釋液
(1) 製備土壤懸液：稱土樣10g，迅速倒入帶玻璃珠的無菌水瓶中(90ml)，振盪20min使土樣充分打散，即成為10-1的土壤懸液。
(2) 稀釋：用無菌移液管吸10-1的土壤懸液0.5ml．放入4.
5ml無菌水中即為10-2稀釋液，如此重複，可依次製成10-3一10-8的稀釋液(圖2-1)。注意：操作時管尖不能接觸液面，每乙個稀釋度換用1支移液管，每次吸入土液後，要將移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高於一次，以減少稀釋中的誤差。
圖2-1 稀釋法分離土壤微生物操作過程**
3．稀釋倒平板法測定菌落數的方法
(1) 將培養基加熱熔化，冷至55－60℃，在高氏1號培養基中加入10%酚數滴，在馬鈴薯培養基中加入鏈黴素溶液至終濃度為30ug/ml，混勻後倒入平板。倒平板時要注意無菌操作，見圖3-2。
圖2-1 倒平板的方法
(2)取土壤稀釋液
高氏一號培養平板：取10-3、10-4 兩管稀釋液各0.1ml分別接人相應標號的含該種培養表面的**；
pda培養平板：取10-3、10-4兩管稀釋液各0.1ml，分別接人相應標號的平皿中；
牛肉膏蛋白腖培養平板：取10-6、10-7、10-8三管稀釋液各0.1ml，分別接人相應標號的平皿中；
(3) 塗佈：玻璃塗棒滅菌後，十字塗佈（演示），靜置5-10min。
微生物學實驗指導
微生物學實驗技術教學大綱 課程編號 課程中英文名稱 微生物學實驗技術 授課教師及職稱 李增波 開課院系 教研室 研究室 授課物件 課程類別 選修課 學時 20 學分 2.0 預修課程 相關知識要求 微生物學 授課目的及內容簡介 微生物學實驗課是與微生物學理論課同學期開設的一門重要的技術基礎課。通過本...
微生物學複習
微生物學中的一些問題 第2章純培養 1.冷凍真空乾燥保藏 液氮保藏法是目前使用最普遍 最重要的微生物保藏方法，大多數專業的菌種保藏機構均採用這兩種方法作為主要的微生物儲存手段。t 2.如果要從環境中分離得到能利用對氨基苯乙酸 以2，4 d作為唯一碳源和能源的微生物純培養物，你該如何設計實驗？從對氨基...
微生物學提綱
微生物學 提綱及思考題 1.什麼是微生物?它包括哪些類群?答 微生物是一切肉眼看不見或看不清的微小生物的總稱.包括 原核類的細菌 放線菌 藍細菌 支原體 立克次氏體和衣原體 真核類的真菌 原生動物 和顯微 藻類,以及屬於非細胞類的病毒和亞病毒.2.微生物有哪五大共性？其中最基本的是哪乙個？為什麼？答...