海南大學
實驗教學自編教材
微生物檢測技術實驗
農學院生物技術系編
實驗一細菌學鑑定中常用的生化反應實驗
一、目的要求
了解細菌鑑定中常用的生化反應及其原理。
二、基本原理
微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物。生化反應常用來鑑別一些在形態和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑑定中的重要依據之一。
imvic是吲哚（indol test）、甲基紅（methyl red test）、伏－普（voges-prokauer test）和檸檬酸鹽（citrate test）四個試驗的縮寫，i是在英文中為了發音方便而加上去的。這四個試驗主要是用來快速鑑別大腸桿菌和產氣腸桿菌（enterobacter aerogenes），多用於水的細菌學檢查。大腸桿菌雖非致病菌，但在飲用水中若超過一定數量，則表示受糞便汙染。
產氣腸桿菌也廣泛存在於自然界中，因此檢查水時要將兩者分開。
硫化氫試驗也是檢查腸道桿菌的生化試驗。
吲哚試驗是用來檢測吲哚的產生。有些細菌能產生色氨酸酶，分解蛋白腖中的色氨酸產生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結合，形成紅色的玫瑰吲哚。
但並非所有微生物都具有分解色氨酸產生吲哚的能力，因此吲哚試驗可以作為乙個生物化學檢測的指標。
色氨酸水解反應：
吲哚與對二甲基苯甲醛反應：
大腸桿菌吲哚反應陽性，產氣腸桿菌為陰性。
甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當細菌代謝糖產生酸時，培養基就會變酸，使加入培養基的甲基紅指示劑由橘黃色（ph6.3）變為紅色（ph4.
2），即甲基紅反應。儘管所有的腸道微生物都能發酵葡萄糖產生有機酸，但這個試驗在區分大腸桿菌和產氣腸桿菌上仍然是有價值的。這兩個細菌在培養的早期均產生有機酸、但大腸桿菌在培養後期仍能維持酸性ph4，而產氣腸桿菌則轉化有機酸為非酸性末端產物，如乙醇、丙酮酸等，使ph公升至大約6。
因此大腸桿菌為陽性反應，產氣腸桿菌為陰性反應。
伏－普試驗是用來測定某些細菌利用葡萄糖產生非酸性或中性未端產物的能力，如丙酮酸。丙酮酸進行縮合、脫羧生成乙醯甲基甲醇，此化合物在鹼性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙醯。二乙醯與蛋白腖中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏－普反應陽性；不產生紅色化合物者為陰性反應。
有時為了使反應更為明顯，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。
其化學反應過程如下：
產氣腸桿菌為陽性反應，大腸桿菌為陰性反應。
檸檬酸鹽試驗是用來檢測檸檬酸鹽是否被利用。有些細菌能夠利用檸檬酸鈉作為碳源，如產氣腸桿菌；而另一些細菌則不能利用檸檬酸鹽，如大腸桿菌。細菌在分解檸檬酸鹽及培養基中的磷酸銨後，產生鹼性化合物，使培養基的ph公升高，當加人1％溴麝香草酚藍指示劑時，培養基就會由綠色變為深藍色。
溴麝香草酚藍的指示範圍為：ph小於6.0時呈黃色，ph在6.
0～7.0時為綠色，ph大於 7.6時呈藍色。
硫化氫試驗是檢測硫化氫的產生，也是用於腸道細菌檢查的常用生化試驗。有些細菌能分解含硫的有機物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產生硫化氫，硫化氫一遇培養基中的鉛鹽或鐵鹽等，就形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉澱物．
以半胱氨酸為例，其化學反應過程如下：
大腸桿菌為陰性，產氣腸桿菌為陽性。
三、器材
1、菌種：大腸桿菌，產氣腸桿菌。
2、培養基：蛋白腖水培養基，葡萄糖蛋白腖水培養基，檸檬酸鹽斜面培養基，醋酸鉛培養基。
蛋白腖水培養基:蛋白腖10g，nacl 5g，水1000ml，ph7.6,121℃滅菌20min。
葡萄糖蛋白腖水培養基：蛋白腖5g，葡萄糖5g，k2hpo4 2g，水1000ml，調ph 7.2，分裝，121℃滅菌20min。
檸檬酸鹽培養基：nh4h2po4 1g，k2hpo4 1g，nacl 5g，mgso4 0.2g，檸檬酸鈉2g，瓊脂15-20g，水1000ml，1%溴香草酚藍乙醇液 10ml，將上述試劑加熱溶化後，調ph 6.
8，然後加入指示劑，搖勻，用脫脂棉過濾，分裝，121℃，20min滅菌後製成斜面。注意不要過鹼，以黃綠色為準。
牛肉膏蛋白腖培養基：牛肉膏3g，蛋白腖10g，nacl 5g，瓊脂15-20g，水1000ml，ph 7.0-7.2,121℃滅菌20min。
醋酸鉛培養基：ph 7.4的牛肉膏蛋白腖瓊脂100ml，硫代硫酸鈉0.
25g，10%的醋酸鉛水溶液1ml。將牛肉膏蛋白腖瓊脂加熱溶化，待冷至60℃時加入硫代硫酸鈉0.25g，並調ph7.
2，分裝於三角瓶中，115℃滅菌15min，取出後冷至60℃，加入10%的醋酸鉛水溶液1ml，混勻匯入試管。
在配製檸檬酸鹽斜面培養基時，其ph不要偏高，以淺綠色為宜。吲哚試驗中用的蛋白腖水培養基中宜選用色氨酸含量高的蛋白腖，如用胰蛋白水解素得到的蛋白腖較好。
3、溶液或試劑：甲基紅指示劑，40％koh，5％α－萘酚，乙醚，吲哚試劑等。
四、操作步驟
1、接種與培養
（1）用接種針將大腸桿菌、產氣腸桿菌分別穿刺接入2支醋酸鉛培養基中（硫化氫試驗），置37℃培養48 h。
（2）將上述二菌分別接種於2支蛋白腖水培養基（吲哚試驗），2支葡萄糖蛋白腖水培養基（甲基紅試驗和伏－普試驗），2支檸檬酸鹽斜面培養基和2支醋酸鉛培養基中，置37℃培養2 d。
2、結果觀察
（1）硫化氫試驗：培養48 h後觀察黑色硫化鉛的產生。
（2）吲哚試驗：於培養2d後的蛋白腖水培養基內加3～4滴乙醚，搖動數次，靜置l～3min，待乙醚上公升後，沿試管壁徐徐加人2滴吲哚試劑，在乙醚和培養物之間產生紅色環狀物為陽性反應。
配製蛋白腖水培養基，所用的蛋白腖最好用含色氨酸高的，如用胰蛋自酶水解酪素得到的蛋白腖中色氨酸含量較高。
（3）甲基紅試驗：培養2d後，將1支葡萄糖蛋白腖水培養物內加入甲基紅試劑2滴，培養基變為紅色者為陽勝，變黃色者為陰性。
注意甲基紅試劑不要加得太多，以免出現假陽性反應。
（4）伏－普試驗：培養2 d後，將另 1支葡萄糖蛋白陳水培養物內加人5～10滴40％koh，然後加入等量的 5％α－萘酚溶液，用力振盪，再放入37℃溫箱中保溫 15～30min，以加快反應速度。若培養物呈紅色者，為伏－普反應陽性。
（5）檸檬酸鹽試驗：培養48 h後觀察檸檬酸鹽斜面培養基上有無細菌生長和是否變色。藍色為陽性，綠色為陰性。
五、實驗報告
1、結果
將實驗結果填人下表。「＋」表示陽性反應，「一」表示陽性反應。
2、思考題
（1）討論imvic試驗在醫學檢驗上的意義。
（2）解釋在細菌培養中吲哚檢測的化學原理，為什麼在這個試驗中用吲哚的存在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸？
（3）為什麼大腸桿菌是甲基紅反應陽性，而產氣腸桿菌為陰性？這個試驗與伏－普試驗最初底物與最終產物有何異同處？為什麼會出現不同？
（4）說明在硫化氫試驗中，醋酸鉛的作用。可以用哪種化合物代替醋酸鉛？
實驗二水中細菌總數的測定
一、目的要求
1、學習水樣的採取方法和水樣細菌總數測定的方法。
2、了解水源水的平板菌落計數的原則。
二、基本原理
本實驗應用平板菌落計數技術測定水中細菌總數。由於水中細菌種類繁多，它們對營養和其他生長條件的要求差別很大，不可能找到一種培養基在一種條件下，使水中所有的細菌均能生長繁殖，因此，以一定的培養基平板上生長出來的菌落，計算出來的水中細菌總數僅是一種近似值。目前一般是採用普通肉膏蛋白腖瓊脂培養基。
三、器材
1、培養基：肉膏蛋白腖瓊脂培養基，滅菌水。
牛肉膏蛋白腖培養基：牛肉膏3g，蛋白腖10g，nacl 5g，瓊脂15-20g，水1000ml，ph 7.0-7.2,121℃滅菌20min。
2、儀器或其他用具：滅菌三角燒瓶，滅菌的帶玻璃塞瓶，滅菌培養皿，滅菌吸管，滅菌試管等。
四、操作步驟
1、水樣的採取
（1）自來水：先將自來水龍頭用火焰燒灼 3min滅菌，再開放水龍頭使水流 5min後，以滅菌三角燒瓶接取水樣，以待分析。
（2）池水、河水或湖水：應取距水面10～15 cm的深層水樣，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然後翻轉過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿後，將瓶塞蓋好，再從水中取出，最好立即檢查，否則需放入冰箱中儲存。
2、細菌總數測定
（1）自來水
① 用滅菌吸管吸取 lml水樣，注入滅菌培養皿中。共做兩個平皿。
② 分別傾注約15 ml已溶化並冷卻到45℃左右的肉膏蛋白腖瓊脂培養基，並立即在桌上作平面旋搖，使水樣與培養基充分混勻。
③ 另取一空的滅菌培養皿，傾注肉膏蛋白腖瓊脂培養基15 ml，作空白對照。
④ 培養基凝固後，倒置於37℃溫箱中，培養24 h，進行菌落計數。
兩個平板的平均菌落數即為 lml水樣的細菌總數。
（2）池水、河水或湖水等
① 稀釋水樣：取 3個滅菌空試管，分別加人 9 ml滅菌水。取 lml水樣注入第一管9 ml滅菌水內、搖勻，再自第一管取lml至下一管滅菌水內，如此稀釋到第三管，稀釋度分別為10-1、10-2與10-3。
稀釋倍數看水樣汙濁程度而定，以培養後平板的菌落數在30～300個之間的稀釋度最為合適，若三個稀釋度的菌數均多到無法計數或少到無法計數，則需繼續稀釋或減小稀釋倍數。一般中等汙穢水樣，取10-1、10-2、10-3三個連續稀釋度，汙穢嚴重的取10-2、10-3、10-4三個連續稀釋度。
② 自最後三個稀釋度的試管中各取 lml稀釋水加人空的滅菌培養皿中，每一稀釋度做兩個培養皿。
③ 各傾注 15ml已溶化並冷卻至45℃左右的肉膏蛋白腖瓊脂培養基，立即放在桌上搖勻。
④ 凝固後倒置於 37℃培養箱中培養 24 h。
3、菌落計數方法
（1）先計算相同稀釋度的平均菌落數。若其中乙個平板有較大片狀菌苔生長時，則不應採用，而應以無片狀菌苔生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數。若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其餘的一半菌落分布又很均勻時，則可將此一半的菌落數乘2以代表全平板的菌落數，然後再計算該稀釋度的平均菌落數。
（2）首先選擇平均菌落數在30～300之間的，當只有乙個稀釋度的平均菌落數符合此範圍時，則以該平均菌落數乘其稀釋倍數即為該水樣的細菌總數（見表2－1，例1）。
（3）若有兩個稀釋度的平均菌落數均在30～300之間，則按兩者菌落總數之比值來決定。若其比值小於2，應採取兩者的平均數；若大於2，則取其中較小的菌落總數（見表2－1，例2及例3）。
微生物實驗室檢測規範
6 儀器裝置應保持清潔，一般應有儀器套罩。7 使用儀器時，應嚴格按操作規程進行，對違反操作規程的因管理不善致使儀器械損壞，要追究當事者責任。三 藥品管理 使用制度 1 依據本室檢測任務，制定各種藥品試劑採購計畫，寫清品名 單位 數量 純度 包裝規格，出廠日期等，領回後建立帳目，專人管理，每半年做出消...
微生物實驗指導
實驗一微生物培養基的配製和滅菌 培養基是將微生物生長繁殖所需要的各種營養物質，用人工方法配製而成的各種營養基質。它具有微生物正常生活所需的各種養料和適宜的環境條件 1 適當組分和比例的營養物質 2 適宜的ph值 3 合適的滲透壓 4 保持無菌狀態。所以培養基是培養微生物所必需的最主要材料。培養基的配...
實驗室微生物檢測報告
1.材料與方法 1 1 材料 1 1 1 培養基 肉膏蛋白腖瓊脂平板。1 1 2 溶液和試劑 無菌水。1 1 3 儀器和其他用品 滅菌棉籤 裝在試管內 試管架，煤氣燈或酒精燈，記號筆和廢物缸等。1 2 步驟和方法 1 2 1 培養基的製作 1 2 1 1 稱量 製作十二個肉高蛋白瓊脂平板，約需要稱量...