功能微生物的
篩選、培養與選育
生科院0901
21090917
2023年11月30日
概要：以產抗生素細菌的篩選和選育為目標，通過培養基製備及滅菌、菌種的分離純化、菌種的鑑定、培養條件的優化以及誘變育`種五個實驗，學習相關的實驗技術和方法.
關鍵詞：分離純化、滅菌、酶活性、誘變
一、材料與方法：
1.11牛肉膏蛋白腖培養基的配製
配方（g/l）：牛肉膏 3，蛋白腖 10，nacl 5，瓊脂 20，ph7.0～7.2。
注：配製3000ml，分裝20支固體斜面試管（不超過試管高度的1/3）和20支液體試管（不超過試管高度的1/3），其餘分裝於1l三角瓶，每瓶500ml。
不同ph值
配製1(g/l)：牛肉膏 3，蛋白腖 10，nacl 5 ph 4.0
配製2(g/l)：牛肉膏 3，蛋白腖 10，nacl 5 ph 7.2
不同碳源
配製3：澱粉 3g，蛋白腖 10g，k2hpo4 1.5g，mgso4·7h2o 1.5g，去離子水 1000ml ph 7.2
配製4：葡萄糖3g，蛋白腖 10g，k2hpo4 1.5g，mgso4·7h2o 1.5g，去離子水 1000ml ph 7.2
不同氮源
配製5：硝酸鈉10g，葡萄糖3g，k2hpo4 1.5g，mgso4·7h2o 1.5g，去離子水 1000ml ph 7.2
配製6：蛋白腖 10g，葡萄糖3g ，k2hpo4 1.5g，mgso4·7h2o 1.5g，去離子水 1000ml ph 7.2
1.12無菌水的準備
50ml三角瓶內盛入18ml蒸餾水，放入8～10顆玻璃小珠，加蓋瓶塞，包紮待滅菌；
50ml三角瓶內盛入18-20ml蒸餾水，加蓋瓶塞，包紮待滅菌；
1.13滅菌材料與器皿的包紮
1.試管的包紮：7支試管為一包紮單位，用報紙將試管塞部分包紮嚴實並繩之以紗線；
2.三角瓶的包紮：用報紙將瓶塞部分包紮嚴密，並以紗線系之；
3.培養皿的包紮：6個平皿為一包紮單位，用報紙以滾筒方式將其包緊；
4. 玻璃移液管的包紮：每1支吸管為包紮單位，用細長條報紙以捲菸方式扎之
5. 1.5ml離心管的包紮：6個離心管為包紮單位，用報紙包成小包。
固體斜面的擺放
注：斜面長度不超過試管長度的1/2
1.14滅菌
首先將含有培養基的三角瓶和試管放入滅菌鍋，注意不要讓培養基傾斜以防溢位，然後再放入其它的玻璃器材。滅菌物品之間不要擺放太擠，以保證高壓蒸汽滅菌能夠徹底。
1.21土壤樣品的採集
在國教中心前取土，天氣晴朗，用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5～25cm處的土樣10～25g，裝入事先準備好的滅菌信封內。
1.22製備土壤稀釋液：
稱取土壤2g，放入18ml帶有玻璃珠的無菌水三角瓶中，振盪5min，即為稀釋10－1的土壤懸液，土壤懸液80℃水浴加熱10分鐘，然後在離心管中依次稀釋至10-2 、10-3等稀釋度。
1.23製備澱粉培養基平板
制5塊牛膏蛋腖培養基平板
具體制法為：倒入融化好的澱粉瓊脂培養基（溫度為不燙手為宜）並輕輕搖晃混勻，置於桌面冷卻為平板。
在無菌培養皿底部註明個人資訊（分離菌名、稀釋度、組別、班級）。
1.24 a吸取稀釋液
無菌操作法分別吸取10－1、10－2 、10－3土壤稀釋液0.1ml，分別加在已製好的3塊澱粉平板培養基上。
b塗板用玻璃刮鏟將稀釋液在培養機上充分混勻鋪平，倒置於恆溫箱培養。
1.25培養
置於504房間30℃培養24小時。
1.26觀察水解圈的產生並測其半徑。
a、48小時後，在之前稀釋塗佈的三塊澱粉培養基上選取典型的單個菌落，並用記號筆在平板背面進行編號。然後將編號後的菌落用無菌牙籤挑取，在備用的澱粉培養基平板上分別劃線接種（編號與被挑菌落相同）
b、將碘液滴加在之前稀釋塗佈的三塊澱粉培養基上，觀察是否有水解圈的產生，並測量其半徑。
c、根據水解圈的有無以及大小判定有關菌落是否產生澱
粉酶，並記錄該菌落編號，並將接種有分離平板上菌
落的備用澱粉瓊脂平板冰箱儲存留作後續實驗之用。
1.27菌種活化
在1.28前的48h將平板菌種接入牛肉膏蛋白腖液體試管活化，並接種一支斜面試管保藏。
提前18h按0.2％接種量分別轉接如下五種液體搖瓶發酵培養基：
1 牛肉膏蛋白腖培養基30℃培養
2 牛肉膏蛋白腖培養基18 ℃培養
3 牛肉膏檸檬酸鈉培養基 30℃培養
4 牛肉膏硝酸鈉培養基30℃培養
5 牛肉膏蛋白腖培養基ph4 30℃培養
1.28不同條件對澱粉酶活性的影響測定
a倒制澱粉培養基平板一塊。培養基倒入量要求不要太多，盡量薄一點，鋪滿平板底部即可。
b用小濾紙片分別蘸取各瓶18小時培養物少許，要求不要蘸太多，保證每片所蘸培養物盡量一致
c如右圖所示，將小濾紙片貼在澱粉培養基表面，並分別在底板上做上標記
d將平板置於30 ℃培養箱作用1h。然後將碘液鋪在平板上，分別測量水解圈的大小
1.29不同條件對菌體生長量影響的測定
a將培養18小時後液體搖瓶培養物分別取出3ml於比色杯中，在721型分光光度計600nm波長下測定吸光度。如果菌液濃度過大，可做適當稀釋後再進行測量。
b分別記錄各種不同培養基和不同培養條件下od600值大小，評價對菌體生長量的影響。
產澱粉酶菌種的鑑定
1.31產澱粉酶待檢菌的培養特徵與形態特徵的觀察與鑑定
1.培養特徵的觀察：菌落形狀與大小，邊緣，表面，隆起形狀，透明度，菌落與培養基顏色等；
2.細菌細胞的顯微觀察：細胞形狀是桿狀（長桿或短桿）還是球狀？有無芽孢？有無莢膜？
3.細菌的革蘭氏染色：按照實驗二的操作方法進行（設立標準的革蘭氏陽性和陰性菌為對照）。
1.32細菌的16s rdna分子鑑定
反應體系：在乙個pcr管中用微量移液槍依次加入列物質：
taq buffer（10×） 2.5μl
mgcl2（25mm1 μl
dntp（2.5 mm） 2.5 μl
primer forward（50 mm1 μl
primer reverse（50 mm1 μl
ddh2o16.5 μl
用滅菌牙籤挑取單菌落於pcr管中，使菌體懸浮於反應體系中。
rtaq（2u/μl） 0.5 μl
pcr反應條件：95℃預變性15 min後，95℃變性1 min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25個迴圈，72℃延伸10min。
1.33瓊脂糖凝膠電泳
1.制膠：配製0.7%瓊脂糖溶液20ml，用1×tae電泳緩衝液做溶劑，加熱溶解，稍冷後，加入模具中，插入梳子，待膠凝固；
2.製樣：pcr反應結束後，取出pcr管，吸取5 μl與1μl 6×樣品buffer混合後全部點入浸於tae電泳緩衝液中的瓊脂糖凝膠的樣品孔中；
3.電泳：100v電泳20min；
4.染色：將凝膠置於樣品染料溴化乙錠中染色；10min，然後將凝膠置於紫外燈下進行檢測，當在凝膠上出現預期大小的dna條帶（約1.
5kb），則認為是pcr陽性，這時將與此電泳樣品對應的pcr反應管放置冰箱短期儲存。
1.34pcr擴增片段測序
獲得的pcr陽性樣品由專人送往測序公司進行測序，大約一周後測序結果可以返回，然後在電腦的相關軟體上進行讀序。
1.35序列比對分析
使用ncbi **對待測菌的16srdna 序列與資料庫中各種菌的16srdna 序列進行比對。登陸 美國國立生物技術資訊中心**，使用blastn 在genebank+embl+ddbj+pdb 基因庫中進行同源性搜尋。從genebank 中選擇近與待測菌目的基因序列同源性最高的已知分類的菌株的16srrna基因序列, 初步確定待測菌的分類位置。
用clustal軟體將已知分類菌株的16srrna序列與待測菌的16srrna序列進行多序列比較。
1.41菌種的活化與接種
每組提前40 h將分離的產澱粉酶菌株轉接至試管斜面，30 ℃培養箱培養。
培養24 h後，每組挑取一環活化菌株，接種至含10ml澱粉培養基的50ml三角瓶中，於25℃，150 r/min的搖床中振盪培養。
1.42 誘變
a.菌懸液的製備
取出培養約16h 的搖瓶，取0.5ml菌懸液（吸取前三角瓶要搖勻）於離心管中（每組3管），5000 r/min離心5min，棄上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2次，加入1.5ml無菌生理鹽水製成菌懸液。
b.平板製作
融化澱粉培養基，每組倒4塊平板，在平板上做好標識。
c. 誘變處理
(1)開啟紫外燈預熱10-20 min。
(2)紫外處理：取製備好的菌懸液3 ml 移入6 cm 的無菌培養皿中，將上述平皿置於紫外燈下的脫色搖床上，開啟皿蓋，距離紫外燈管 30cm，照射3min（單號排）或者6min（雙號排），蓋上皿蓋。
(3)稀釋菌液：在超淨台內，將照射後的菌懸液用無菌水按10倍稀釋法依次稀釋成10-1-10-5（在dorf管中進行）。
(4)塗佈平板：取10-3、10-4（單號組）和 10-4、10-5（雙號組）兩個稀釋度的菌懸液各0.1ml塗佈均勻。
以同樣的操作，取未經紫外線處理的菌懸液稀釋塗佈平板作為對照。
平板於37℃倒置培養48 h(用黑布包好平板)。
1.43計算成活率和致死率
a. 存活率
將培養48 h 後的平板取出進行細胞計數。根據平板上菌落數，計算出對照樣品1 ml 菌液中的活菌數。
b．致死率
將培養48 h 後的平板取出進行細胞計數。根據平板上菌落數，計算出對照樣品1 ml 菌液中的活菌數。
1.44觀察誘變效應
在平板菌類計數後，分別向菌落數在5~6個左右的平板內加入碘液，分別測量透明圈直徑與菌落直徑並計算比值(h/c值)，與對照平板進行比較（紫外照射和對照組隨機選出6個算平均值）。
選取h/c 比值大的菌落移接到新鮮牛肉膏斜面上培養，用於複篩。
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