（一）目的要求
了解培養基配製過程各環節的要求和注意事項。
了解培養基的配製原理。
（二）基本原理
正確掌握培養基的配製方法是從事微生物學實驗工作的重要基礎。由於微生物種類及代謝型別的多樣性，因而用於培養微生物培養基的種類也很多，它們的配方及配製方法雖各有差異。但一般培養基的配製程式卻大致相同，例如器皿的準備，培養基的配製與分裝，棉塞的製作，培養基的滅菌，斜面與平板的製作以及培養基的無菌檢查等基本環節大致相同。
（三）實驗材料
1. 藥品
待配各種培養基的組成成分、瓊脂、1mol/l naoh溶液、1mol/l hcl溶液等。
2. 儀器
天平或台秤、高壓蒸汽滅菌鍋。
3. 玻璃器皿
移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養皿、玻璃漏斗等。
4. 其它物品
藥匙、稱量紙、ph試紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙、報紙等。
（四）實驗步驟
1. 玻璃器皿的洗滌
玻璃器皿在使用前必須洗刷乾淨。將錐形瓶、試管、培養皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中，用毛刷刷洗，然後用自來水及蒸餾水沖淨。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。
洗刷乾淨的玻璃器皿置於烘箱中烘乾後備用。詳見附錄一。
2. 滅菌前玻璃器皿的包裝
(1) 培養皿的包裝：培養皿由一蓋一底組成一套。可用報紙將幾套培養皿包成一包，或者將幾套培養皿直接置於特製的鐵皮圓筒內，加蓋滅菌。包裝後的培養皿須經滅菌之後才能使用。
(2) 移液管的包裝：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作用是避免外界及口中雜菌吹入管內，並防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應距管口約0.
5cm左右，棉花自身長度約1～1.5cm。塞棉花時，可用一外圈拉直的回形針，將少許棉花塞入管口內。
棉花要塞得鬆緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為準。
先將報紙裁成寬約5cm左右的長紙條，然後將已塞好棉花的移液管尖端放在長條報紙的一端，約成45角，折迭紙條包住尖端，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉，以螺旋式包紮起來。上端剩餘紙條，折迭打結，準備滅菌(見圖3－1)。
3. 液體及固體培養基的配製過程
1）液體培養基配製
稱量：一般可用1/l00粗天平稱量配製培養基所需的各種藥品。先按培養基配方計算各成分的用量，然後進行準確稱量。
溶化：將稱好的藥品置於一燒杯中，先加入少量水(根據實驗需要可用自來水或蒸餾水)，用玻棒攪動，加熱溶解。
定容：待全部藥品溶解後，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時，可預先配成較濃溶液，然後按比例吸取一定體積的溶液，加入到培養基中。
調ph：一般用ph試紙測定培養基的ph。用剪刀剪取一小段ph試紙，然後用鑷子夾住ph試紙，在培養基中蘸一下，**其ph範圍，如培養基偏酸或偏鹼時，可用1mol/l naoh或1mol/l hcl溶液進行調節。
調節ph時，應逐滴加入naoh或hcl溶液，防止區域性過酸或過鹼，破壞培養基中成分。邊加邊攪拌，並不時用ph試紙測試，直至達到所需ph為止。
過濾：用濾紙或多層紗布過濾培養基。一般無特殊要求時，此步可省去。
2）固體培養基的配製
配製固體培養基時，應將已配好的液體培養基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.5％～2％)加入，並用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續加熱至瓊脂全部融化，最後補足因蒸發而失去的水分。
4. 培養基的分裝
根據不同需要，可將已配好培養基裝入試管或錐形瓶內，分裝時注意不要使培養基沾汙管口或瓶口，造成汙染。如操作不小心，培養基沾汙管口或瓶口時，可用鑷子夾一小塊脫脂棉或捲紙，擦去管口或瓶口的培養基。
1）試管的分裝
取乙個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，並將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾住玻璃管嘴，使培養基直接流入試管內(圖3－2)。
圖3－2 培養基的分裝
裝入試管培養基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時，液體培養基可分裝至試管高度l/4左右為宜；如分裝固體或半固體培養基時，在瓊脂完全融化後，應趁熱分裝於試管中；用於製作斜面的固體培養基的分裝量為管高1/3(約10 m1)；半固體培養基分裝量為管高的1/3為宜。
2）錐形瓶的分裝
用於振盪培養微生物用時，可在250m1錐形瓶中加入50m1的液體培養基；若用於製作平板培養基用時，可在250ml錐形瓶中加入150m1液體培養基，然後再加入3g瓊脂粉(按2％計算)，滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。
5. 棉塞的製作及試管、錐形瓶的包紮
為了培養好氣性微生物，需提供優良通氣條件，同時為防止雜菌汙染，則必須對通入試管或錐形瓶內空氣預先進行過濾除菌。通常方法是在試管及錐形瓶口加上棉花塞等。
1）試管棉塞的製作
制棉塞時，應選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展於左手拇指和食指扣成的圓孔上，用右手食指將棉花從**壓入圓孔中製成棉塞，然後直接壓入試管或錐形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折迭卷塞法製作棉塞(圖3－3)。
製作的棉塞應緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過鬆，塞好後以手提棉塞，試管不下落為準。棉塞的2/3在試管內，1/3在試管外(圖3－4)。目前也有採用金屬或塑料試管帽代替棉塞，直接蓋在試管口上，滅菌待用。
將裝好培養基並塞好棉塞或蓋好管帽的試管捆成一捆，外麵包上一層牛皮紙。用鉛筆註明培養基名稱及配製日期。滅菌待用。
2）錐形瓶棉塞製作
通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進行液體振盪培養加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上。目前也有採用無菌培養容器封口膜直接蓋在瓶口上，既保證良好通氣，過濾除菌又操作簡便，故極受歡迎。
在裝好培養基並塞好棉塞或包上八層紗布或蓋好培養容器封口膜的錐形瓶口上，再包上一層牛皮紙並用線繩捆好，滅菌待用。
圖3－4 試管帽和棉塞
1.試管帽；2.正確的棉塞；3.不正確的棉塞；4.不正確的棉塞
6. 培養基的滅菌
培養基經分裝包紮之後，應立即進行高壓蒸汽滅菌，121℃滅菌20 min。如因特殊情況不能及時滅菌，則應暫存於冰箱中。
7. 斜面和平板的製作
1）斜面的製作
將已滅菌裝有固體培養基的試管，趁熱置於木棒上，使成適當斜度，凝固後即成斜面(圖3－5)。斜面長度為試管長度1/3，底層長為試管的2/3。如製作半固體或固體深層培養基時，滅菌後則應垂直放置至冷凝。
2）平板的製作
將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的固體培養基融化後，待冷至50℃左右傾入無菌培養皿中。倒平板時，培養基溫度過高，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低於50℃，培養基易於凝固而無法製作平板。
平板的製作應在火旁進行，左手拿培養皿，右手拿錐形瓶的底部或試管，左手同時用小指和手掌將棉塞開啟，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養皿蓋開啟一縫，至瓶口正好伸入，傾入10～12 m1的培養基，迅速蓋好皿蓋，置於桌上，輕輕旋轉平皿，使培養基均勻分布於整個平皿中，冷凝後即成平板(圖3－6)。
8. 培養基的無菌檢查
滅菌後的培養基，一般需進行無菌檢查。最好從中取出1～2管(瓶)，置於37℃溫箱中培養1～2d，確定無菌後方可使用。
9. 無菌水的製備
在每個250 m1的錐形瓶內裝99 m1的蒸餾水並塞上棉塞。在每支試管內裝4.5 m1蒸餾水。
塞上棉塞或蓋上塑料試管蓋。再在棉塞上包上一張牛皮紙。高壓蒸汽滅菌，121℃滅菌20 min。
（五）實驗報告內容
1. 簡述移液管包裝注意事項。
2. 簡述配製液體培養基的簡單步驟。
3. 簡述斜面及平板培養基的製作過程。
（六）思考題
1. 為什麼微生物實驗室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞上一小段棉花，再用報紙包起來，經高壓蒸汽滅菌後才能使用？
2. 為什麼微生物實驗室所用的錐形瓶口或試管口都要塞上棉塞，經高壓蒸汽滅菌後才能使用？製作合格棉塞的標準是什麼？
3. 配製培養基時為什麼要調節ph?
4. 配製固體培養基時，需在液體培養基中新增多少量的瓊脂？
5. 將含瓊脂的培養基分裝至試管中應如何操作？注意事項是什麼?
6. 製作斜面培養基時，其斜面長度應相當於試管長度幾分之幾為宜？
7. 製作平板培養基的注意事項是什麼？
8. 培養基配好後，為什麼必須馬上進行高壓蒸汽滅菌?如不能及時滅菌時，應將培養基暫時放置何處？
9. 如何檢查滅菌後的培養基是否無菌？
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