黑麴黴發酵生產α-澱粉酶
前言：α-澱粉酶能隨機地作用於澱粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，所得產物的還原性末端葡萄糖單位碳原子為α構型，同時該酶能使澱粉漿的粘度下降，因此又稱為液化酶。耐酸性α-澱粉酶是在酸性條件下水解澱粉的酶類，其最適ph在4.
0左右。自從日本研究者 yasujiminoda等人用黑麴黴生產耐酸性α-澱粉酶以來，各國都對耐酸性α-澱粉酶進行了研究。
通過黑麴黴發酵生產α-澱粉酶的實驗過程，熟悉發酵罐的構造和使用方法。初步了解發酵生產的原理和常規發酵引數的檢測方法。整個實驗按照「菌種的培養空消實消
接種發酵放罐」的發酵過程進行。在整個發酵的過程中，每隔6h取一次發酵液樣品檢測其ph值、酶活、殘糖量及生物量四個生理指標。最後將所測資料進行整理、分析，可以得出整個發酵過程各物質的生成和消耗的變化規律以及如何調整培養條件來提高發酵生產的效率，對大工業生產具有重要的指導意義。
正文：一、 實驗目的
1．了解發酵罐的幾大系統組成，即空氣系統、蒸汽系統、補料系統、進出料系統、溫度系統、**控制系統。
2．掌握發酵罐空消的具體方法及步驟
3．掌握發酵罐進料及實消的具體方法及步驟
4．掌握發酵罐各系統的控制操作方法
二、 實驗原理
1. 蒸汽系統：
蒸汽發生器：主要用於滅菌，分為自動加水和手動加水兩種方式。
2. 溫度系統：
(1) 夾套公升溫：蒸汽通入夾套。
(2) 夾套降溫：冷水通入夾套，下進水，上出水。
(3) 發酵過程自動控溫系統
3. 空氣系統：
空氣除菌裝置：空壓機貯氣罐油水分離器空氣流量計空氣過濾器發酵罐
4. 補料系統：補加培養基、消泡劑、酸鹼等。
5. **控制系統
6. 進出料系統：進料口（接種口）、出料口（取樣口）
7. 管道：包括水流通管道和氣流通管道
水流通：冷卻用水：水經過進水管道發酵罐夾套出水口
保溫用水：關閉進出水管道閥門（水注滿後） 加熱保溫進入夾套
氣流通：蒸汽發生器蒸汽管道空氣過濾器/發酵罐
進入罐內
空氣：空壓機貯氣罐油水分離器空氣流量計空氣過濾器發酵罐
三、 方法與注意事項
㈠原則1. 通蒸汽前先關閉所有閥門
2．粗過濾器不空消也不實消，要定期處理，所以必須關閉通向粗過濾器的閥門。
3．活蒸汽，滅過頭，即尾汽不能關死，要保證有活蒸汽放出，但不能太大，以免分壓。
4．罐體排汽口排汽，並保持罐內正壓。
5．空氣過濾系統只空消，不實消，以免罐中物料衝入過濾器內。但空消一結束，即要通入無菌空氣吹乾管路並保壓，避免染菌。
6．進蒸汽時順著蒸汽管路開閥門，結束時逆著進路關閥門，先開尾閥後開主閥，結束時先關主閥後關尾閥。
8．蒸汽一停，即由無菌空氣充入保持罐內正壓。
㈡ 空消
先開啟蒸汽發生器，自有蒸汽產生併排掉管路中冷凝水後，按以下步驟進行：
1．先關閉所有閥門，檢查處是否關緊密封，開啟罐上方排氣口。
2．蒸汽先進空氣系統，蒸汽→蒸汽過濾器→分過濾器，無論蒸汽走到哪一路得先放尾閥，放出冷凝水，排掉冷空氣，待有蒸汽衝出後調小，開啟主閥。
3．再進罐體：由主路進罐，然後通入取料管路，再入補料系統（兩邊）。
4．罐壓公升至所需溫度（121℃）時開始計時，保溫保壓30min。
保壓方式：（1）調節主汽路進汽閥門控制進汽量；（2）調節排氣口排氣量大小或尾閥放汽量。
5．結束空消：（1）逆著蒸汽進路關，先關近罐閥。（2）同時準備好壓縮空氣確保蒸汽一停即充入無菌壓縮空氣以維持空氣系統及罐內的正壓。近罐空氣閥的尾閥要一直微開啟。
注意：空消前應檢查夾套中是否殘留了冷水，若有，影響罐體公升溫，須自夾套出水口將水放出。
㈢ 種子製備：接種黑麴黴於pda液體培養基中，液體搖瓶培養。
㈣ 培養基配製、實消
發酵培養基配方：可溶性澱粉200 g，檸檬酸氫二銨100 g，kh2po4 15 g，cacl2 0.5 g，feso4.
7h2o 0.05 g，mgso4.7h2o 0.
5 g，加水定容至5 l，ph5.0，消泡劑（植物油）5 ml。
關閉氣路入罐閥，主汽路進汽→補料口進汽（方法同空消）→罐壓公升至0.12mpa（121℃），保壓、保溫30分鐘→實消結束。
㈤ 冷卻接種與發酵
待培養基冷卻至28℃左右時，在加料口周圍放一圈酒精棉球，點燃，在無菌條件下開啟進料口，迅速接種。
將溫度、攪拌轉速、通氣量等引數設定好後，進行發酵。
㈥引數監測
每隔6 h取一次樣，檢測其ph、生物量、酶活及殘糖含量等指標。
ⅰ. ph的測定：標準液校準ph計後，測定樣品ph值。
ⅱ. 生物量的測定：每次取20-30ml的發酵液，先用大離心機(5000 rpm, 3-5 min)離心，收集上清液，用小離心機（10000rpm，1min）用來測酶活，沉澱用水清洗幾次後再離心，然後將所得沉澱放入100℃烘箱中，烘乾（2 h左右），然後測其乾重，取平均值。
ⅲ. 酶活：
試劑：（1）碘液：稱取0.5g i2 和5.0gki 研磨溶解於少量蒸餾水，定容至100ml，於褐色試劑瓶內儲存，避免陽光直射。
（2）稀碘液：取原碘液1ml稀釋100倍。此溶液現配現用
（3）0.5%澱粉液：稱取乾燥過的可溶性澱粉0.
5克，加5ml緩衝液，攪拌混和，再徐徐傾入70毫公升煮沸的緩衝液中。繼續煮沸2分鐘，冷卻至室溫，定容至100ml。此溶液需要當天配製
(4) 磷酸緩衝液（ph 6.0）：0.2 mol/l k2hpo4 (12.3ml)+0.2 mol/l kh2po4(87.7ml)
方法：取5ml 0.5% 的可溶性澱粉溶液，在40℃水浴中預熱10 min，然後加入適當稀釋(6.
0的磷酸鹽稀釋緩衝液)的酶液0.5ml，反應5min後，用5ml 0.1mol/l h2so4 終止反應。
取0.5 ml 反應液與5 ml 碘液顯色，在620 nm處測光密度。以0.
5 ml水代替0.5 ml反應液為空白，以不加酶液（加同樣體積的緩衝液）的管為對照（即取5ml 0.5% 的可溶性澱粉溶液，在40℃水浴中預熱10 min，然後加入6.
0的磷酸鹽稀釋緩衝液0.5ml，反應5min後，用5ml 0.1mol/l h2so4 終止反應。
取0.5 ml 反應液與5 ml 碘液顯色）。酶活力根據下式計算：
酶活力（u/ml）＝(r0-r)/r0×50×d，式中r0，r分別表示對照和反應液的光密度，d為酶的稀釋倍數。調整d使(r0-r)/r0在0.2-0.
7之間。確定在40℃、5 min 內水解1 mg澱粉的酶量為乙個活力單位。
ⅳ. 殘糖量的測定：硫酸-蒽酮法測殘糖含量
（1）原理
醣類與濃硫酸脫水生成糖醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產生顏色物質，反應後溶液呈藍綠色，於620 nm處有最大吸收，顯色與多醣含量有線性關係。
（2）試劑
①蒽酮試劑。溶解0.2 g蒽酮於濃硫酸（a.
r. 95.5 %）100 ml中，當日配製試用。
具體實驗過程中，應視樣品分數多少來準備蒽酮試劑的配置量。比如實測樣品有50份，為了保證結果的可靠性，安排個份樣品試驗重複數為3。因為每個試驗點實測需要4 ml蒽酮試劑，所以至少應配置的體積為4×3×50＝600 ml。
此時還應考慮預實驗和實驗差錯所消耗蒽酮試劑量。
②標準糖試劑。葡萄糖溶液（可加數滴甲苯防腐）
（3）操作及其注意事項
分別取0.1 g/l的葡萄糖溶液0.05，0.
10，0.20，0.30，0.
40，0.60，0.80 ml，用蒸餾水補到1.
00 ml，分別加入4.00 ml蒽酮試劑，迅速進入冰水浴中冷卻，各管加完後一起浸入沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發。自水浴重新煮沸開始計時，準確煮沸10 min，冷卻後進行比色。
以光密度為縱座標，糖的含量微克數為橫座標，製作標準曲線。或使用計算器進行一元回歸得出計算式，以便於計算使用。
（4）樣品含量測定
取糖濃度為50μg/ml左右的樣品溶液1.00ml，一式3份分別置於不同試管中，對照加入1.0ml蒸餾水，然後給各管加入蒽酮試劑，以標準曲線方法進行比色測定。
根據標準曲線和樣品濃度計算含量。
色氨酸含量較高的蛋白質對顯色反應有一定的干擾。此外，試管在加入蒽酮試劑過程中，移液管尖端在試管中所停留的高度對於加入蒽酮試劑的速度影響較大，而且對反應產生顏色的深淺都會產生一定的影響。因此，實驗操作應該注意。
㈦後續工作：罐體清洗，藥品整理歸類，物品放好
㈧資料處理
(1)葡萄糖標準曲線
（2）發酵液ph值的變化
發酵液ph隨時間變化曲線圖
（3）生物量的變化
生物量隨時間變化曲線圖
（4）殘糖量變化
殘糖含量隨時間變化曲線圖
（5）酶活變化
酶活隨時間變化趨勢
四、實驗結果分析
1、ph值得變化：0-6h變化幅度不大，此時菌處於潛伏期內種代謝不旺盛，故ph的變化不大。12-18小時有所波動，可能是取樣時出現誤差，理論上應該是在0=18小時變化不大。
18小時過後，隨後隨著菌種的活化，菌種新陳代謝的旺盛co2的釋放增加，ph值逐漸下降，且下降速度逐漸加快。
2、生物量變化：理論上生物量整體上是呈上公升趨勢。但是在18小時時，出現生物量很明顯的增大，顯然資料出現誤差。
可能是烘乾時沒有幹的徹底，雜質摻入，或是統計資料時出現錯誤。在這之後，生物量出現緩慢上公升趨勢，這是因為在發酵期間培養基的營養成分是夠黑麴黴生長所需的,它的增殖受到環境的影響不是很大,故其一直在增殖.第60小時資料偏低，可能是離心不徹底使部分產物損失。
此外生物量曲線出現較大的波動可能是操作的人員不同，實驗手法也不一樣，導致最終結果有所偏差。
實驗七尿澱粉酶活性測定
澱粉酶 amy或ams 在體內的主要作用是水解澱粉，它隨機地作用於澱粉分子內的 1，4糖苷鍵生成葡萄糖 麥芽糖 寡糖及糊精。血清中的澱粉酶主要有胰型 p型 和唾液型 s型 及其亞型同工酶組成，p型澱粉酶主要 於胰腺，s型澱粉酶主要 於唾液腺。正常澱粉酶因分子量小，故可從腎小球濾過而由尿中排出。目的 ...
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一 摘要 採用離子交換樹脂分離蛋白，掌握離子交換柱層析法的基本操作技術。用層析柱 蠕動幫浦 自動部分收集器 紫外分光光度計等儀器洗脫蛋白質分子，成功分離純化，得到洗脫曲線，得出穿透峰 洗脫峰1 洗脫峰2三個峰。二 材料與裝置 澱粉酶溶液 離子交換樹脂 平衡緩衝液 洗脫緩衝液 含0.3m氯化鈉的平衡緩...
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