一、 實驗目的：
1. 掌握從環境中採集樣品並從中分離純化某種微生物的完整操作步驟。
2. 鞏固以前所學的微生物學實驗技術。
3. 學習澱粉酶活性的測定方法。
二、 實驗原理：
1. α-澱粉酶是一種液化型澱粉酶，它的產生菌芽孢桿菌，廣泛分布於自然界，尤其是在含有澱粉類物質的土壤等樣品中。
2. 從自然界篩選菌種的具體做法，大致可以分成以下四個步驟：取樣、富集培養、初步篩選、分離純化和效能測定。
a) 取樣：即採集含菌種的樣品
採集含菌樣品前應調查研究一下自己打算篩選的微生物在哪些地方分布最多，然後才可著手做各項具體工作。在土壤中幾乎各種微生物都可以找到，因而土壤可說是微生物的大本營。例如廚房土壤、麵粉加工廠和菜園土壤中澱粉的分解菌較多。
b) 富集培養：
富集培養就是在所採集的土壤等含菌樣品中加入某些物質，並創造一些有利於待分離微生物生長的其他條件，使能分解利用這類物質的微生物大量繁殖，從而便於我們從其中分離到這類微生物。
c) 初步篩選：
i. （選擇培養基）初篩使用選擇培養基對菌種進行培養，通過培養基的特殊成分，來篩選出目的菌種，從而進行培養。
ii. （鑑別培養基）初篩利用鑑別培養基，通過新增一些特殊的試劑或成分來鑑別出目的菌種，從而篩選出來並對其進行培養。
d) 分離純化：
通過上述的篩選只能說我們要分離的目的菌種已經存在，但還要把夾雜在其中的雜菌除去，從而得到純種的菌落。純種分離的方法很多，主要有：平板劃線分離法、稀釋分離法、單孢子或單細胞分離法、菌絲尖端切割法等。
e) 效能測定：
分離純化得到的菌種之後，所分得的菌種是否具有實驗所要求的效能，還必須要進行效能測定後才能決定取捨。
三、 實驗材料：
1. 培養基配製：
a) 培養基按以下比例配製後，加蒸餾水調至100%；
b) 富集培養基：可溶性澱粉1%、蛋白腖1%、葡萄糖0.5%、nacl 0.5%、瓊脂粉0.8%、牛肉膏0.5%、ph7.0；
c) 分離培養基：玉公尺粉2%、黃豆餅粉1.5%、cacl 0.
02%、mgso4 0.02%、nacl 0.25%、k2hpo4 0.
2%、檸檬酸鈉0.2%、硫酸銨0.075%（溶解後加入）、na2hpo40.
2%、ph7.0。
2. 主要試劑和溶液的配製：
a) 2%澱粉溶液：準確稱取澱粉2g溶於100ml 0.1mol/l ph5.6的檸檬酸緩衝液中。
b) 0.1mol/l的檸檬酸緩衝液、ph=1.0的鹽酸
c) 1%的3，5-二硝基水楊酸：精確稱取1g3，5-二硝基水楊酸，溶於20ml 2mol/l氫氧化鈉溶液中，加入蒸餾水50ml，再加入四水酒石酸鉀鈉30g，待溶解後用蒸餾水定容100ml，蓋緊瓶塞，隔絕co2。
d) 0.1%葡萄糖溶液：準確稱取80℃烘乾至恒重的無水葡萄糖0.1g，去離子水溶解後定容至100ml。
e) 0.1%標準麥芽糖溶液：稱取麥芽糖100mg，用蒸餾水溶解並定容至100ml。
四、 實驗方法：
1. 取樣與稀釋：
a) 從實驗樓前的小樹林中採集土樣，稱取5g土樣，放入裝有 45ml無菌水的三角瓶中, ** 20m in後靜置 5min。然後對其進行濃度梯度稀釋到10-6, 分別稀釋到10-4、10-5、10-6濃度下。
2. 富集培養：
a) 從上述土壤稀釋液中各取1 ml注入無菌培養皿中，然後倒入滅菌並融化冷卻至50℃左右的富集培養基，小心搖動冷凝後，倒置於37℃保溫箱中培養24小時。
3. 初步篩選：
a) 培養24小時後，取出平板，向平板中注入1滴革蘭氏碘液，因澱粉遇碘變藍色，如菌落周圍有無色透明圈，說明該菌能分解澱粉，即該菌株可以產生澱粉酶。通過影印法或點種法將可以產生澱粉酶的菌株接種到相同的無菌培養中，重複操作進行培養。
4. 分離純化：
a) 初篩所得的菌落中選擇菌落周圍透明圈和菌落直徑之比值較大的菌落，進行劃線分離。將劃線分離後的培養皿放入37 ℃ 培養箱中培養24小時。
5. 效能測定：
a) 標準曲線的製作：
i. 取7支20ml預先潔淨滅菌乾燥的試管，編號，加入試劑見表1。每個濃度做3個平行樣本。
搖勻，至沸水浴中煮沸5min。取出後流水冷卻，加蒸餾水定容至20ml，以1號管作為空白調零點，在520nm的波長下比色測定吸光度值，並建立通過吸光度值求麥芽糖含量的回歸方程。
表1 澱粉酶標準曲線的製作
b) 酶活力測定：
i. 首先製備待測粗酶液：取培養好菌株的分離培養基進行4000rpm離心20min，並收集上清液即為待測粗酶液。
ii. 取20ml預先潔淨滅菌乾燥的具塞刻度試管，編號。並按步驟操作：
取粗酶液1.0ml → 加2%的可溶性澱粉1ml，蒸餾水3ml，於60 ℃水浴中預熱5min → 加0.1ml/l檸檬酸緩衝液（ph6.
0）1ml於60 ℃水浴中保溫30min → 加3，5-二硝基水楊酸1.5ml，沸水浴中煮沸5min，迅速冷卻，加蒸餾水定容至20ml。
iii. 空白對照：取粗酶液1.0ml，加入ph1.0的鹽酸鈍化澱粉酶，使酶失活，在按照以上步驟操作。定容、搖勻後，用分光光度計測定520nm處的od值。
iv. 在上述條件下，以單位體積樣品在30min釋放1mg麥芽糖所需的酶量為乙個麥芽糖單位表示酶活性。
五、 結果與分析：（待測）
「產澱粉酶菌株的篩選」設計方案
一 實驗目的 1.掌握從環境中採集樣品並從中分離純化某種微生物的完整操作步驟。2.鞏固以前所學的微生物學實驗技術。3.學習澱粉酶活性的測定方法。二 實驗原理 1.澱粉酶是一種液化型澱粉酶，它的產生菌芽孢桿菌，廣泛分布於自然界，尤其是在含有澱粉類物質的土壤等樣品中。2.從自然界篩選菌種的具體做法，大致...
《澱粉酶對澱粉和蔗糖的水解作用》的教學設計
指導老師 組長 組員 姓名 學號 一 教學目標 1 知識 初步學會探索酶催化特定化學反應的方法 探索澱粉酶是否只能催化特定的化學反應 2 能力 學習實驗 的方法 初步掌握評價和報告實驗結果的能力 3 情感態度價值觀 變被動地接受式學習為主動地 式學習。對學生進行嚴格訓練，培養學生的科學態度，在實驗中...
澱粉酶的離子交換層析實驗
一 摘要 採用離子交換樹脂分離蛋白，掌握離子交換柱層析法的基本操作技術。用層析柱 蠕動幫浦 自動部分收集器 紫外分光光度計等儀器洗脫蛋白質分子，成功分離純化，得到洗脫曲線，得出穿透峰 洗脫峰1 洗脫峰2三個峰。二 材料與裝置 澱粉酶溶液 離子交換樹脂 平衡緩衝液 洗脫緩衝液 含0.3m氯化鈉的平衡緩...