產葡萄糖氧化酶黴菌的選育及發酵條件優化
試驗方法：
一、葡萄糖氧化酶的產生菌黴菌的篩選與鑑定
預處理：取1g混合土壤於倒入帶玻璃珠的99ml無菌水的無菌三角瓶中，使土樣充分打散。
富集培養：將土壤懸液分別稀釋至10-4、10-5、10-6 ，並分裝於若干只裝有pad培養基的三角瓶中，28 ℃中培養48h，不同稀釋度分別塗佈平板培養。
初篩：挑選出所需菌株於斜面培養基培養，並顯微觀察菌株，初步篩選出所需菌株。
直接製片觀察法：滴一滴乳酸石碳酸棉藍染液於載玻片上，用鑷子從所篩出的菌株pad平板培養物中取菌絲，先放入50%乙醇中浸一下洗去脫落的孢子，然後置於染液中，用解剖針小心將菌絲分開，去掉培養基，蓋上蓋玻片，用低倍鏡鏡檢。
複篩：向斜面菌種中加入無菌水，洗下孢子接種於種子培養基中，於30 ℃、110r/min搖床培養2h。按5%的接種量接種於發酵培養基中於30 ℃、110r/min搖床發酵7d。
提取發酵液中的酶後測定其酶活，篩選出所需菌株。
二、產葡萄糖氧化酶高產菌株的亞硝基胍誘變育種
將篩選得到的葡萄糖氧化酶產生能力最強的菌株活化後接種到液體pad培養基中，30 ℃、110r/min搖床培養2h。取200μl菌液塗佈平板，在平板稍靠邊的乙個位點上放少許亞硝基胍結晶，然後將平板倒置於28 ℃中培養24h。
增殖培養：挑取緊靠抑菌圈外側的少許菌苔到盛有20ml 液體pad培養基的三角瓶中，搖勻，製成菌懸液，同時挑取遠離抑菌圈的少許菌苔到另一盛有20ml 液體pad培養基的三角瓶中，搖勻，製成對照菌懸液，將其置於28 ℃中培養24h。
塗佈平板：分別取上述兩種培養液的菌懸液200μl塗佈平板，置於28 ℃中培養48h。挑取單菌落於斜面培養基中培養保藏。
酶活測定：挑取上述斜面菌體接種於發酵培養基中，於30 ℃、110r/min搖床發酵7d，提取發酵液中的酶並測定其酶活。與出發菌株作比較，篩選出高產菌株。
三、高產菌株發酵條件的優化
通過正交試驗對高產菌的發酵條件進行優化，建立高產菌株的最佳搖瓶發酵條件。
將選出的正突變菌株在培養基中培養12-16h後，將種子瓶中的培養液以5%的接種量分別接種在發酵培養基和不同優化條件的培養基中，發酵48h後，提取發酵液中的酶並測定其酶活，分析確定最佳搖瓶發酵條件。
表2 實驗因素與水平
表3 不同處理的試驗
四、酶活力的測定
酶活定義：在ph5.6，溫度為30℃條件下每分鐘催化1μmol葡萄糖轉化為葡萄糖酸和過氧化氫所需的葡萄糖氧化酶的量為乙個酶活力單位(u)。
酶活測定方法：underbofler滴定法，原理是用鹼滴定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化產生的葡萄糖酸。具體操作是取250ml三角瓶，加入2%葡萄糖磷酸緩衝液(ph 5.
6) 25ml及1ml 酶液，迅速與30℃下振盪1h，然後加入0.1mol/l naoh溶液20ml使反應終止，用0.1mol/l hcl滴定剩餘的naoh，記錄消耗的鹽酸毫公升數為a；對照樣在加酶液之前加入0.
1mol/l naoh溶液20ml，不必振盪，其它操作相同，記錄所消耗的鹽酸毫公升數為b。計算式為：
god酶活=[(b-a)*f*n*1000]/60(μmol/min)
式中：n—鹽酸濃度(0.1mol/l)，f—稀釋倍數
5、活性菌株的鑑定
對篩選出的菌體進行18srdna進行鑑定。
培養基：
pda：馬鈴薯200g 馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然後
蔗糖（或葡萄糖） 20g用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化後補
瓊脂15~20g 足水至1000ml。121℃ 滅菌30min。
水1000ml
ph自然
斜面培養基：nano3 0.2%、 k2hpo4 0.
1%、 kcl 0.05%、 mgso4 0.05%、 葡萄糖 4%、 瓊脂 1.
5%~2.0%； ph 自然，121℃滅菌30min。
發酵培養基：葡萄糖 6%、 蛋白腖 0.3%、 nano3 0.
4%、 k2hpo4 0.2%、 kcl 0.05%、 mgso4.
7h2o 0.07%、 caco3 1%、 ph 自然，115℃滅菌20min。
試劑：ph 5.6 的磷酸緩衝液（0.
1 mol/l）：在80ml蒸餾水中溶解kh2po4 12.45g和k2hpo4 1.
94g，轉移至容量瓶中加水定容至1000ml，儲存於室溫。
5%葡萄糖溶液：在50ml蒸餾水中溶解5.0g葡萄糖，轉移至容量瓶中加水定容至100ml，儲存於4℃冰箱。
轉葡萄糖苷酶
申報資料 dossier 食品新增劑新品種 new food additive 轉葡糖苷酶 transglucosidase 通用名稱 轉葡糖苷酶 transglucosidase 李氏木黴trichoderma reesei 供體 黑麴黴 aspergillus niger 功能分類 加工助劑食品...