實驗目的：
1.掌握分光光度計的使用方法。
2.掌握標準管法測物質含量的方法。
3.掌握雙縮脲法測定蛋白質含量的方法。
一、原理：
雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物，在鹼性溶液中與硫酸銅反應生成紫紅色絡合物，此反應即為雙縮脲反應。含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都具有雙縮脲反應。
蛋白質含有多個肽鍵，在鹼性溶液中能與cu2+絡合成紫紅色化合物。其顏色深淺與蛋白質的濃度成正比，可以用比色法進行測定。雙縮脲法最常用於需要快速但並不需要十分精確的測定
2、試劑和器材
(1) 標準蛋白溶液（5mg/ml）:準確稱取已定氮的酪蛋白(乾酪素或牛血清白蛋白)用0．05mol/l氫氧化鈉溶液配製，冰箱存放備用。
(2) 雙縮脲試劑:溶解1.5g硫酸銅（cuso4·5h2o）和6.
0g酒石酸鉀鈉（nakc4h4o6·4h2o）於500ml蒸餾水中，在攪拌下加入300ml10％氫氧化鈉溶液，用水稀釋到1000ml，貯存於內壁塗以石蠟的瓶內。此試劑可長期儲存。
(3) 樣品血清:動物血清用水稀釋10倍，置於冰箱儲存備用。標準曲線法所用的血清需20倍稀釋。
器材:分析天平、分光光度計、 恆溫水浴箱、 試管、 吸量管等
三、操作方法：
1.取三支試管按下錶操作
2、搖勻，37℃水浴20min後用分光光度計於540nm波長處比色，以空白管調零點，測得各管吸光度。
3、計算：
血清總蛋白質(g／100ml）＝a測/a標×0.005×100/0.1
實驗原理：雙縮脲（nh3conhconh3）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出乙個分子氨後得到的產物。在強鹼性溶液中，雙縮脲與cuso4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。
凡具有兩個醯胺基或兩個直接連線的肽鍵，或能過乙個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定範圍為1~10mg蛋白質。
干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、tris緩衝液和某些氨基酸等。
（1）此法的優點是較快速 ，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用於需要快速，但並不需要十分精確的蛋白質測定。
（二）試劑與器材
1.試劑：
（1）標準蛋白質溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白（bsa）或標準酪蛋白，配製成10mg/ml的標準蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為 0.66來校正其純度。
如有需要，標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據其純度，稱量配製成標準蛋白質溶液。牛血清清蛋白用h2o或0.9%nacl配製，酪蛋白用0．05n naoh配製。
（2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（cuso45h2o）和 6.
0克酒石酸鉀鈉（knac4h4o64h2o），用500毫公升水溶解，在攪拌下加入300毫公升10% naoh溶液，用水稀釋到1公升，貯存於塑料瓶中（或內壁塗以石蠟的瓶中）。此試劑可長期儲存。若貯存瓶中有黑色沉澱出現，則需要重新配製。
2.器材：
可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。
（三）操作方法
1.標準曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.
2，0.4，0.6，0.
8，1.0毫公升的標準蛋白質溶液，用水補足到1毫公升，然後加入4毫公升雙縮脲試劑。充分搖勻後，在室溫（20~25℃）下放置30分鐘，於540nm處進行比色測定。
用未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪製標準曲線。
2、樣品的測定：取2~3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。
紫外吸收
原理蛋白質分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等殘基，它們的結構中具有共軛雙鍵，對紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波長處。在此波長附近，蛋白質溶液的光吸收值與其含量（範圍是0.1~1.
0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白質的定量測定。若將已知不同濃度的蛋白質標準溶液在 280nm處測定，並作標準曲線，即可求得未知溶液的蛋白質濃度。此法測定迅速，用量較少，而且不消耗樣品和試劑。
但若樣品中含有其他在280nm吸收的物質，如嘌呤嘧啶等化合物時，就有干擾作用。
（二）試劑及器材
（1）標準蛋白質溶液：準確稱取經凱氏定氮法校正的結晶牛血清白蛋白，配製成濃度為1mg/ml的溶液。
（2）待測蛋白質溶液：濃度為1mg/ml左右的蛋白質溶液。
（三）操作
1. 280nm的光吸收法
（1）標準曲線的繪製：取8支試管，編號後按下表加入試劑。
混勻，選用光程為1cm的石英比色杯，在紫外分光光度計280nm波長處以0號管調「零」分別測定各管溶液的光密度（od280）。以縱座標為光密度值，橫座標為蛋白質濃度繪出標準曲線。
（2）樣品測定：取待測蛋白質溶液1ml，加入蒸餾水3ml，混勻，按上述方法測定280nm波長處的光密度值，並從標準曲線上查出待測蛋白質的濃度。
2．280nm和260nm的吸收差法將待測的蛋白質溶液稀釋到光密度在0.2~2.0之間，在波長280nm和260nm處以相應的溶液作空白對照，分別測得待測樣品的光密度值（od280和od260）。
應用280nm和260nm的吸收差法經驗公式直接計算出蛋白質濃度。
蛋白質計算方法
蛋白質 多肽 分子的相關計算 氨基酸在核醣體上通過脫水縮合形成蛋白質 多肽 每形成乙個肽鍵就脫去一分子的水，故水的分子數 肽鍵的數。兩個氨基酸形成的二肽有乙個肽鍵，三個氨基酸形成的三肽有兩個肽鍵.依次類推，n個氨基酸形成一條肽鏈的蛋白質 多肽 肽鍵數為n 1，用數學歸納法推知，n個氨基酸形成x條肽鏈...
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晚上再吃家宴，沒敢吃肉和蝦，只吃了4兩鱖魚 按一半純肉100克算，約18克蛋白質 加上2兩公尺飯 7克蛋白質 200克蔬菜 2克蛋白質 再加上飯後嗑瓜子100克，純瓜子仁按40克算 8克蛋白質 再考慮水果半斤多還有大約1克蛋白質，共計36克蛋白質。如此，非常保守的吃法，相當符合中國居民膳食寶塔的各類...