一、研究背景
蛋白質是生物的重要組成部分，在人類發現蛋白質後一直沒有停下過研究得腳步。在實
驗室提取蛋白質的過程中，目標蛋白質的**是廣泛的，而不同的樣品中目標蛋白質的含量是不同的，為了得到更多的目標蛋白，就需要了解樣品中蛋白質的含量。在實際的生活中也需要運用蛋白質含量的測定，例如牛奶、奶粉中蛋白質含量。記得前幾年轟動一時三聚氰胺事件，國家的標準蛋白質檢測方法被不法分子所利用，通過蛋白質檢測方法的缺陷來謀取暴利。
目前常用的蛋白質檢測方法有五種：凱式定氮法、folin-酚法、考馬斯亮藍法、紫外法、雙縮脲法。不同的方法有不同的優缺點。
二、研究目標
通過四種不同的蛋白質測定方法了解各種方法的優缺點。在不同的條件下，能選擇正確的測定方法，從而獲得正確的資料。
三、研究策略
根據資料可以知道四種方法的侷限性，針對這乙個單一的變數設計五組實驗。乙個是標準對照組，其他四組分別在標準組的基礎上引入一種變數。用四種方法分別測定五種溶液。
在對同一種溶液的測定結果中，必有一種方法的結果和其他的結果有顯著差異，同時與標準液的結果也有顯著的差異。我們就認為這組溶液中的變數對於該蛋白質測定的方法影響較大。
四、研究方案及可行性分析
研究方案：
1、配置一組濃度梯度的標準液，分別用四種方法測定，並建立標準曲線。
2、配置五種等濃度的樣品蛋白質溶液並編號abcde。在配置過程中，a組加10毫公升蒸餾水；b組加10毫公升嘌呤溶液；c組加入10毫公升edta溶液；d組加入10毫公升雙氧水溶液；e組加入10毫公升鹽酸溶液。
3、分別用四種方法測定五種蛋白質溶液。
4、分析結果
可行性分析：
更具已有資料設計了四個單一的變數，分別針對四種實驗的缺點，同時保證沒有其他的變數。
預期結果：
在每組實驗的結果中分別有乙個資料是在橫向和縱向上都有顯著差異的。我們可以確定這個變數對該實驗有很大的影響。
五、具體實驗設計
1. 建立標準曲線
紫外法a.儀器：紫外分光光度儀、移液管、試管和試管架
試劑：標準牛血清蛋白溶液
b.主要步驟
按照上表分別向沒知識觀眾加入各種試劑，混勻。選用光程為1cm的石英比色杯，在280nm下測其光密度值。以od值為縱座標，繪製標準曲線。
雙縮脲法
a.儀器：分光光度計，分析天平，振盪機刻度吸管，具塞三角瓶，漏斗
試劑：雙縮脲試劑，0.05mol/l的naoh，標準酪蛋白溶液配製成5mg/ml的溶液
b.主要步驟
**15min，室溫靜置30min，540nm比色，以蛋白含量(mg/ml)為橫座標，吸光度為縱座標，繪製標準曲線。
folin-酚法
a.儀器：722型分光光度計，恆溫水浴，具塞刻度吸管15ml*8，小燒杯*2，漏斗及架，分析天平，移液管（0.5ml*1,1ml*2,5ml*1），容量瓶（50ml*1），研缽
試劑：試劑甲（a:10g碳酸鈉，2g氫氧化鈉，0.
5g酒石酸鉀鈉溶液溶解後蒸餾水定容至500ml；b:0.5g五水硫酸銅溶解後，蒸餾水定容至100ml；使用前將a與b按50:
1比例混合，混合液有效期1天），試劑乙（1.5l磨口回流器中加入100g鎢酸鈉和25g鉬酸鈉及700ml蒸餾水，再加入50ml85%的磷酸，100ml濃鹽酸充分混合，小火回流10h結束後加入150g硫酸鋰，50ml蒸餾水及數滴溴，開口沸騰15min。稀釋至1l，過濾，使用時加入大約一倍的水），牛血清蛋白標準溶液，在分析天平上精確稱取0.
0250g結晶牛血清蛋白，溶解後轉入100ml容量瓶中，配成標準液（250μg/ml）。
b.主要步驟
根據上表配好溶液，以後各加試劑甲5ml，混合後在室溫下放置10min，再加入0.5ml試劑乙（要立即混勻）。半小時後以不含蛋白質的1號管為對照，用722型分光光度計計於650nm的波長下比色，記錄消光值。
以消光值為縱座標，牛血清蛋白含量為橫座標，繪製曲線。
考馬斯亮藍g-250法
a.儀器：721或722型分光光度計，離心機，分析天平（萬分之一），藥物天平，量筒10ml*1，研缽，燒杯，量瓶10ml*1，刻度吸管1ml*2,0.
1ml*2，具塞刻度試管10ml*4，漏斗及架，剪刀
試劑：牛血清蛋白，考馬斯亮藍g250，乙醇
b.主要步驟
（1）0-100μg/ml標準曲線的製作
取6支試管，按下錶資料配製成標準溶液各1ml
準確吸取所配置的溶液1ml，分別放入10ml的具塞試管中，加入5ml考馬斯亮藍g250蛋白試劑，蓋塞，將試管中溶液縱向倒轉混合，放置2min後用10mm光徑的比色杯在595nm下比色，做出標準曲線。
（2）0-1000μg/ml標準曲線的製作
與步驟（1）操作相同，做出0-1000μg/ml標準曲線。
2. 測定待測液蛋白質含量
紫外法a.配置相同濃度的待測液5個並編號abcde。在配置過程中，a組加10毫公升蒸餾水；b組加10毫公升嘌呤溶液；c組加入10毫公升edta溶液；d組加入10毫公升雙氧水溶液；e組加入10毫公升鹽酸溶液。
b.分別取待測液abcde1ml，加入蒸餾水3ml混勻，測其od280，然後再標準曲線上查出待測液的蛋白質濃度。
c.測定od280和od260，並計算od280/ od260的比值，根據校正資料表查出此時的校正因子。
d.將原始資料代入經驗公式：蛋白質濃度(mg/ml)=f*(1/d)*od280*d
od280為該溶液在280nm下的紫外吸收，d為石英比色杯的厚度(cm)，d為溶液稀釋倍數。
e.計算此時蛋白濃度與未加入干擾時的相對誤差，確定是否有明顯影響。
雙縮脲法
a.將磨碎的樣品在80℃條件下烘乾至恒重。取出至於乾燥器中冷卻待用。
b.稱取烘乾的樣品約0.2g兩份，分別放入兩個乾燥三角瓶中。
然後再個瓶中分別加入5ml0.05mol/l的氫氧化鈉潤濕，之後再加入20ml的雙縮脲試劑，**15min，室溫中靜置30min，分別過濾，取濾液在540nm波長下比色。在標準曲線上查出相應的蛋白質含量(mg)。
c.稱取烘乾的樣品約0.2g四份，配置五種等濃度的樣品蛋白質溶液並編號bcde。
在配置過程中，b組加10毫公升嘌呤溶液；c組加入10毫公升edta溶液；d組加入10毫公升雙氧水溶液；e組加入10毫公升鹽酸溶液。測定每乙份的蛋白含量d.將原始資料e.
代入公式：樣品蛋白含量（%）=從標準曲線上查得的蛋白含量（mg）/樣品重*100*酪蛋白純度。
folin-酚法
a.分別稱取綠豆芽下胚軸1g於研缽內，加入適量石英砂，勻漿，轉入50ml容量瓶中，定容過濾。獲得樣品液。
配置相同濃度的待測液5個並編號abcde。在配置過程中，a組加10毫公升蒸餾水；b組加10毫公升嘌呤溶液；c組加入10毫公升edta溶液；d組加入10毫公升雙氧水溶液；e組加入10毫公升鹽酸溶液。
b.取具塞試管兩支，分別加入1ml濾液，分別加入試劑甲5ml，混合均勻後放置10分鐘。然後各加試劑乙0.
5ml，迅速混勻，室溫下放置30min，於650nm波長下比色，記錄吸光值，取平均值完成計算。
原始資料代入公式：樣品蛋白含量（%）=*100%，比較在迅速混合的條件下和有時間間隔的條件下的相對誤差。
考馬斯亮藍法
a.稱取3g新鮮綠豆芽下胚軸，放入研缽中，滴加適量蒸餾水研成勻漿，轉移至離心管仲，放置30min-60min，在4000轉/分離心20min，過濾沉澱，上清液轉入容量瓶，以蒸餾水定容至50ml。配置相同濃度的待測液5個並編號abcde。
在配置過程中，a組加10毫公升蒸餾水；b組加10毫公升嘌呤溶液；c組加入10毫公升edta溶液；d組加入10毫公升雙氧水溶液；e組加入10毫公升鹽酸溶液。
b.吸各個取待測液1ml做乙個平行，放入具塞試管中，加入5ml考馬斯亮藍g250，充分混合，放置2min後用10mm光徑比色杯在595nm下比色，記錄消光值，以標準曲線1號試管做空白。
c.原始資料代入公式，樣品蛋白含量=a*(提取液總體積/測定取用體積)/樣品重(g)，計算相對誤差。
3.預期原始資料記錄
紫外法雙縮脲法
folin-酚法
考馬斯亮藍法
六、質疑及相關思考
1.四個變數並不一定是最具有代表性的。
各組加入的試劑量有待商榷，加入的試劑濃度也沒有確定。
七、預習思考題
1.先了解該物質的化學物理性質
其次，確定該物質存在於生物體系中的那個部位或那個部位數量最多
再次，了解目標部位中還存在什麼物質，了解這些物質的性質
最後，選用合適的方法提取。
2.結構複雜、容易失活。提取條件溫和，保證生物化合物的活性，同時操作要謹慎防止以機械方式破壞結構。
3.生物大分子容易失去活性。緩衝液可以保證大分子的ph環境適宜，防止失活。防止緩衝液中的離子干擾生物化合物的檢測。
利用定氮儀測定樣品中蛋白質含量的操作方法
1 樣品消化 100ml消化瓶中 樣品 固體0.2 2.0g，液體10 20ml 催化劑 硫酸鉀6g 硫酸銅0.2g 濃h2so420ml，混合加熱至澄清透明的藍綠色溶液，即消化液。將消化液冷卻 移入100ml容量瓶定容備用。2 定氮儀的準備 1 觀察蒸發爐內水位，不能超過不鏽鋼電極。如果超過，請先...
紫外分光光度法測定蛋白質的含量
標準曲線的製作 用吸量管分別吸取0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 ml 5.00 mg ml標準蛋白質溶液於5只10 ml 比色管中，用0.9 nacl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9 nacl溶液為參比，在280 nm處分別測定各標準溶液的吸光度a278記錄所得讀數。樣品...
蛋白質計算方法
蛋白質 多肽 分子的相關計算 氨基酸在核醣體上通過脫水縮合形成蛋白質 多肽 每形成乙個肽鍵就脫去一分子的水，故水的分子數 肽鍵的數。兩個氨基酸形成的二肽有乙個肽鍵，三個氨基酸形成的三肽有兩個肽鍵.依次類推，n個氨基酸形成一條肽鏈的蛋白質 多肽 肽鍵數為n 1，用數學歸納法推知，n個氨基酸形成x條肽鏈...