3、sds-page分析
（1）樣品的處理
取1 ml菌液，10000 rpm離心1 min，棄上清，重懸於100 l 去離子水，加入100 l 2×sds凝膠上樣緩衝液，渦旋混勻，100 ℃加熱3-5分鐘，10000 rpm離心3 min備用。
（2）sds-page凝膠的製備
①按下列配方組成配製4 ml 12%分離膠
h2o 1.32 ml，30%凝膠貯備液1.6 ml，分離膠緩衝液1 ml，10%sds 0.
04 ml，10%過硫酸銨0.04 ml，最後加入temed 0.002 ml。
②一旦加入temed，混勻後立即小心將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，注意為積層膠留有足夠的空間。輕輕在其頂層加入2 ml去離子水，覆蓋凝膠，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。
③聚合完成之後，倒掉覆蓋在凝膠上層的液體，盡可能用濾紙吸幹凝膠頂層的殘存液體。
④按下列配方組成配製1 ml 5%積層膠
h2o 0.675 ml，30%凝膠貯備液0.1675 ml，積層膠緩衝液0.
125 ml，10%sds 0.01 ml，10%過硫酸銨0.01 ml，最後加入temed 0.
001 ml。
將積層膠灌入分離膠上面，插入梳子，垂直放置於室溫下。
⑤積層膠聚合完成後，用去離子水沖洗梳孔。將凝膠放入電泳槽上，加入電泳緩衝液，小心拔出梳子。
（3）電泳
①安裝好電泳槽，將電極插頭與適當的電極相連。
②開始時電壓為8v/cm，染料進入分離膠後，將電壓增加到15 v/cm。繼續電泳直到染料到達分離膠底部，斷開電源。
③取下凝膠，將凝膠置於考馬斯亮藍染色液中放搖床上緩慢旋轉3-4小時或過夜。
④換掉並**染色液。用脫色液浸泡凝膠，緩慢搖動4-8小時，其間換液3-4次。繼續脫色，直到滿意為止。
⑤用凝膠成像系統對凝膠進行照相和分析。
我們一般都是用乙醇的：
染色液：1g考蘭（r－250），300ml乙醇，100乙酸，純水定容至1000ml.攪拌過夜，再過濾
脫色液：500ml乙醇，100ml乙酸，純水定容至1000ml
我們這是生產用量，你可以按比例減量
（切膠免疫）
兔1、抗原製備
（1）配製10%分離膠和5%濃縮膠,將濃縮後的蛋白與10×電泳加樣緩衝液混合，100℃煮沸10分鐘,進行恆流電泳,濃縮膠電壓為80v,分離膠電壓為180v。
（2）電泳後,將凝膠用考馬斯亮藍r250染色。
（3）在分子量約為3kda處可見較寬條帶,切取該條帶,進行研磨,-20℃凍存。
2、動物免疫
（1）將製備好的抗原分別免疫2隻大耳白雌兔,首次免疫劑量為1 mg /只,經皮下多點及腹腔注射,
（2）3週後進行第二次免疫,劑量及免疫途徑同首次免疫。
（3）二次免疫後測定血清效價,並用western確認免疫效果。
3、高丰度蛋白多轉殖抗體的製備
免疫效果驗證的大耳白兔,經心臟穿刺放血處死,動物血靜置2小時,2000r/min離心,獲得動物血清,此即多轉殖抗體。
4、western蛋白印記鑑定多轉殖抗體
（1）將超濾濃縮後腮腺液分別與2×還原型及非還原型電泳加樣緩衝液混合,100℃煮沸10分鐘,製備還原型及非還原型樣本
（2）進行常規恆流電泳,電泳後,電轉於硝酸纖維素膜上,電壓18v,時間30分鐘
電轉後,將硝酸纖維素膜置於5%脫脂奶粉進行封閉1小時以上,免疫後兔血清(多抗)1∶1000稀釋作一抗進行孵育過夜,正常兔血清1∶1000稀釋作陰性對照,tbst作空白對照
（3）次日,tbst洗膜4次,15min /次,辣根過氧化物酶標記羊抗兔及辣根過氧化物酶標記羊抗兔(igg)1∶10000稀釋作二抗孵育1小時,tbst洗膜3次,tbs洗膜1次，15min /次,**1～2min,顯影。
3、擴大培養
將bl-pet-fat/cd36菌液接種到4 ml la液體培養基中，37 ℃，200 rpm振搖培養過夜。
取500 l培養過夜的菌液接種到含500 ml la液體培養液的三角培養瓶中，共6瓶，37 ℃，200 rpm振搖培養至od600至0.6~0.8時，加入1 m的iptg，使iptg終濃度為0.
5 mm，誘導6 h
4、蛋白純化
（1）融合蛋白的變性裂解上清液的製備
由於表達產物為包涵體的非可溶性蛋白，因此需進行蛋白質的變性，操作步驟如下：
①4 ℃，10000 rpm離心10 min收集菌體。
②稱量細菌濕重，按每克細菌溼重用5 ml 8 m尿素的1×結合緩衝液，重新懸浮細菌。
③將懸浮液在室溫條件下置搖床上溫和搖動1 h。
④12000 rpm室溫離心20 min。
⑤上清液即為蛋白質的變性液，棄沉澱。
⑥純化之前用0.45 μm濾膜過濾上清。
（2）層析柱的製備
當樹脂沉降、儲存液的液面降至樹脂表面時，按以下順序清洗、離子化和平衡色譜柱：
①3倍體積滅菌去離子水；
②5倍體積1×離子化緩衝液；
③3倍體積8 m尿素的1×結合緩衝液。
（3）柱層析
①待8 m尿素的1×結合緩衝液下降至層析柱表面，小心加入製備好的融合蛋白變性裂解上清液。
②用10倍體積8 m尿素的1×結合緩衝液過柱。
③用6倍體積8 m尿素的1×漂洗緩衝液過柱。
④用6倍體積8 m尿素的1×洗脫緩衝液洗脫結合蛋白，按需要分段收集洗脫緩衝液。
⑤用3倍體積8 m尿素的1×結合緩衝液過柱。
⑥用1倍體積8 m尿素的1×結合緩衝液儲存層析柱。
2.2.4.16 蛋白的透析
（1）將成捲的透析袋剪下適用的長度（一般為20-30 cm），在過量的10 mmol/l nahco3中潤濕透析袋，並煮沸幾分鐘。在5 mmol/l na2edta煮沸幾分鐘。
（2）重複一次。
（3）用去離子水洗數次，於5 mmol/l na2edta（或20%-50%的乙醇）中儲存於4 ℃以防分解纖維素的微生物生長。
（4）在透析袋的一端打兩個死結。
（5）用移液管將欲透析的蛋白移入透析袋。
（6）在透析袋的另一端打兩個死結，並將其依次放入10倍於蛋白質溶液以上體積的蛋白質透析緩衝液ⅰ-ⅸ中，用磁力攪拌器緩慢的攪拌，以促進溶液的交換。在每種緩衝液中透析4 h以上，達到平衡後更換透析液。
（7）將純化蛋白透析到去離子水中。
5、蛋白的濃縮
將透析袋放入20%聚乙二醇溶液中進行蛋白透析
將純化蛋白濃縮至一定體積，取出透析袋
用蒸餾水沖洗4-5次後吸出濃縮的蛋白
再用蒸餾水沖洗透析袋內壁2次。
以稀釋的牛血清白蛋白（bsa）為對照，將濃縮後的蛋白質進行sds-page電泳分析，用核酸蛋白測定儀測定濃度，置於-20 ℃儲存。
誘導公式學生
25 1 化簡 2 若，求的值.26 已知，且，求的值。27 化簡 28 已知sin 3 求的值 25 1 2 解析 試題分析 1 由誘導公式化簡可得，牢記誘導公式 奇變偶不變，符號看象限 2 將正余弦轉化為正切的形式,可得.試題解析 解 1 2 若，則,考點 誘導公式，同角間的基本關係式.26 解...
三角函式誘導公式及記憶方法
三角函式誘導公式 目錄誘導公式的本質 常用的誘導公式 其他三角函式知識 公式推導過程同角三角函式的基本關係式 同角三角函式關係六角形記憶法 1.兩角和差公式 2.二倍角的正弦 余弦和正切公式 3.半形的正弦 余弦和正切公式 4.萬能公式 5.三倍角的正弦 余弦和正切公式 6.三角函式的和差化積公式 ...
誘導公式教學反思
三角函式誘導公式 教學反思 這節課先回顧三角函式的定義以及誘導公式一,再用課本中的 三個問題引導學生利用圓的對稱性和三角函式定義以小組為單位 並回答問題，老師和學生共同得出誘導公式二。再讓學生模擬公式二的推導過程自己動手推導誘導公式三和四。讓學生觀察這些公式的特點並嘗試著用文本來概括公式二到五，教師...