雙水相萃取相圖的繪製
1．實驗目的
⑴掌握繪製雙水相相圖的方法
⑵理解雙水相形成條件和定量關係
2．實驗原理
雙水相是指某些高聚物之間或高聚物與無機鹽之間在水中以一定的濃度混合而形成互不相容的兩相，由於溶質在兩相間的分配係數的差異而進行萃取的方法即為雙水相萃取。雙水相形成條件和定量關係常用相圖來表示（見圖1）。成相物質都能與水無限混合，當它們的組成位於曲線的上方時（用m點表示）體系就會分成兩相，分別有不同的組成密度，輕相（或稱上相）組成用t點表示，重相（或稱下相）組成用b點表示，t、b點稱為節點。
直線tmb稱為系線，是相圖的重要特徵，關係到相的平衡組成。所有組成在系線上的點，分成兩相後，其上下相組成均分別為t、b，但是其體積比（vt/vb）不同。相體積比可由相圖上線段比（bm/mt）估算，即服從槓桿規則。
本實驗繪製peg/(nh4)2so4體系雙水相相圖。
圖1 雙水相體系相圖
3．實驗材料及儀器
peg1000原液（0.6g/ml，w/w=56.926%，密度1.
054）；peg2000原液（0.4g/ml，密度1.02）；硫酸銨原液（0.
43g/ml，密度1.2）。
4． 實驗方法
準確稱取2.0mlpeg原液，加入25 ml具塞刻度試管中，然後逐滴加入硫酸銨原液，混合，直至試管中開始出現混濁為止，記錄加入硫酸銨量，算出peg和硫酸銨在系統中的質量百分濃度，再向試管中加入適量水（0.2~0.
5~1.0 ml），使體系變澄清，記錄加入水的量，並繼續加入硫酸銨，使體系再次變混濁，如此反覆操作二十幾次，計算達到混濁時peg和硫酸銨在系統中的質量百分含量，得出不同相對分子量的peg和硫酸銨的雙節線相圖節點。
以上述試驗所得結點繪製出不同相對分子量的peg/(nh4)2so4體系雙水相相圖。
5． 資料處理
表1 相圖節點資料
雙水相萃取牛血清白蛋白
1．實驗目的
⑴掌握peg/無機鹽體系雙水相萃取蛋白質的方法
⑵了解影響蛋白質在雙水相體系中分配行為的主要引數
2．實驗原理
雙水相是指某些高聚物之間或高聚物與無機鹽之間在水中以一定的濃度混合而形成互不相容的兩相，由於溶質在兩相間的分配係數的差異而進行萃取的方法即為雙水相萃取。與一般分離純化技術相比，雙水相萃取技術具有處理容量大、能耗低、易連續化操作和工程放大等優點，在蛋白質等生物大分子的分離純化等方面受到廣泛重視，是一種有發展潛力的易於工業化應用的生物分離技術。影響蛋白質及細胞碎片在雙水相體系中分配行為的主要引數有成相聚合物的種類、成相聚合物的分子質量和總濃度、無機鹽的種類和濃度、ph值等。
3．實驗材料及儀器
peg1000原液（0.6g/ml，w/w=56.926%，密度1.
054）；peg2000原液（0.4g/ml，密度1.02）；硫酸銨原液（0.
43g/ml，密度1.2）；牛血清白蛋白標準液（100μg/ml，ph8.0）；考馬斯亮藍g-250蛋白試劑。
紫外可見分光光度計。
4． 實驗方法
4．1萃取牛血清白蛋白
標準曲線的繪製：按下錶加入試劑。搖勻。放置2min後測定595nm吸光度值。以蛋白量（μg）為橫座標，以吸光度為縱座標繪出標準曲線。
萃取方法：取4 ml peg儲液和4ml硫酸銨溶液於乾燥的10 ml刻度試管中，再加入1 ml牛血清白蛋白溶液，混勻，以少量蒸餾水調節體系總質量為10g，混勻，靜置15min，讀取上下相體積及總體積，再將其倒入分液漏斗使上下相分開，並分別測上下相蛋白濃度。
有關計算公式：分配係數m=ct/cb ,相比r =vt/vb，萃取率y=目標相中的蛋白量/上下相中的總蛋白量。
5． 資料處理
5.1牛血清白蛋白標準曲線
5.2 不同相對分子量peg/(nh4)2so4體系萃取牛血清白蛋白
6.思考題
⑴如何利用雙水相相圖控制相比？
⑵peg平均分子量及濃度、(nh4)2so4濃度、ph值等因素如何影響雙水相體系中被提純物質的分配平衡？
雙水相萃取as1.398中性蛋白酶
1．實驗目的
⑴掌握peg/無機鹽體系雙水相萃取蛋白質的方法
⑵了解影響蛋白質在雙水相體系中分配行為的主要引數
2．實驗原理
雙水相是指某些高聚物之間或高聚物與無機鹽之間在水中以一定的濃度混合而形成互不相容的兩相，由於溶質在兩相間的分配係數的差異而進行萃取的方法即為雙水相萃取。與一般分離純化技術相比，雙水相萃取技術具有處理容量大、能耗低、易連續化操作和工程放大等優點，在蛋白質等生物大分子的分離純化等方面受到廣泛重視，是一種有發展潛力的易於工業化應用的生物分離技術。影響蛋白質及細胞碎片在雙水相體系中分配行為的主要引數有成相聚合物的種類、成相聚合物的分子質量和總濃度、無機鹽的種類和濃度、ph值、等。
3．實驗材料及儀器
peg1000原液（0.6g/ml，w/w=56.926%，密度1.
054）；硫酸銨原液（0.43g/ml，密度1.2）；酪氨酸標準液（100μg/ml，ph7.
5）；中性蛋白酶發酵液(培養基abe離心上清液）。紫外可見分光光度計。
4. 實驗方法
4．1萃取中性蛋白酶
標準曲線的繪製：按下錶加入試劑。搖勻。放置2min後測定275nm吸光度值。以酪氨酸（μg）為橫座標，以吸光度為縱座標繪出標準曲線。
萃取方法：取4 ml peg儲液和5ml硫酸銨溶液於乾燥的10 ml刻度試管中，再加入1 ml中性蛋白酶液，混勻，以少量蒸餾水調節體系總質量為10g，混勻，靜置15min，讀取上下相體積及總體積，再將其倒入分液漏斗使上下相分開，並分別測上下相酶活力。
1 ml上相或下相酶液(先於40℃水浴中預熱3分鐘)，加入1 ml 酪蛋白溶液（先40℃預熱3分鐘），搖勻，在40℃水浴中精確反應10min，立刻加入3ml 三氯醋酸，搖動，靜置10min，濾紙過濾，用小試管收集濾液，放置10min。測a275。並作對照
有關計算公式：分配係數m=ct/cb ,相比r =vt/vb，萃取率y=目標相中的蛋白量/上下相中的總蛋白量。
5.資料處理
5.1牛血清白蛋白標準曲線
5.2 不同相對分子量peg/(nh4)2so4體系萃取牛血清白蛋白
6.思考題
⑴如何利用雙水相相圖控制相比？
⑵peg平均分子量及濃度、(nh4)2so4濃度、ph值等因素如何影響雙水相體系中被提純物質的分配平衡？
附表1 相圖的繪製實驗耗材
附表2 萃取牛血清白蛋白實驗耗材
附表3 萃取中性蛋白酶實驗耗材
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