雙水相萃取糖化酶
一、實驗目的
1、了解雙水相萃取在生物活性物質提取中的重要作用與意義，及其與傳統溶媒萃取技術的異同。
2、加深對分配係數k、相比r、收率y等基本概念的認識及相圖的製作，掌握液液萃取中基本實驗技術。
二、實驗原理
雙水相萃取技術是分離純化蛋白質混合物等生物大分子的有效方法。雙水相系統通常是由水溶性的兩種聚合物組成或一種水溶性聚合物與一種鹽組成，相對於傳統溶劑萃取來說，雙水相萃取的最大優勢在於雙水相體系可為生物活性物質提供乙個溫和的活性環境，因而可在萃取過程中保持生物物質的活性和構象，而且雙水相技術具有處理量大、能耗低、易連續化操作和工程放大等優點。
生物大分子在雙水相上相和下相的濃度比被定義為分配係數（k=cb/ct）。在雙水相系統中有許多因素影響分配係數，包括系統本身的因素如系統組成、聚合物分子量、聚合物濃度、鹽和離子強度、ph等，以及目標產物的性質如疏水作用、電荷、分子量等，通過大量實驗研究可以獲得特定蛋白質和生物大分子的最適宜分離的相系統和最優分配的。
糖化酶亦稱澱粉α-1，4葡萄糖苷酶。這類酶作用於澱粉分子末端，從澱粉非還原性末端順次切開α-1，4糖苷鍵，生成葡萄糖。它們也能作用於支鏈澱粉的α-1，6鍵，但速度較慢，因此分解產物全部為葡萄糖，作用結果使醣的還原能力迅速增高。
本實驗選用peg400-(nh4)2so4為雙水相系統，從發酵液中萃取糖化酶。
表觀分配係數
相比收率式中: cb、ct 分別為下、上相酶濃度（活性）；
vb、vt分別為下相、上相的體積。
物料衡算：加入的原液總酶活=上相酶活×上相體積+下相酶活×下相體積
三、實驗儀器與藥品
儀器：天平恆溫水浴離心機液相混合器刻度試管吸管酸式滴定管等
藥品：糖化酶 peg400、(nh4)2so4、2%可溶性澱粉、0.15m naoh、1m h2so4
四、實驗步驟
（一）、peg400-(nh4)2so4雙水相系統相圖的製作
1.配製40％的硫酸銨溶液（已經配好）。在具塞三角瓶中準確稱量7.09g左右的peg400，，再加入5ml水（此時體系澄清）。
2.慢慢加入40％(nh4)2so4溶液，不斷搖勻，直至試管開始出現混濁為止，記錄加入的(nh4)2so4量；
3.再加入適量水（水的加量按實驗記錄部分的表依次進行），使體系變澄清，並繼續加入40％(nh4)2so4，使系統再次變混濁；
4.如此反覆操作，計算達到混濁時peg和(nh4)2so4在系統中的重量百分濃度，得出peg和(nh4)2so4的雙節線圖。
（二）雙水相系統中蛋白質分配係數的測定
1.用乾燥的刻度試管稱取適量peg400，再加入適量40% (nh4)2so4溶液，加入適量水補足到30ml，在混合器上混勻，再加入1ml酶液，於混合器上混合2 min。然後離心5 min。
2.取出讀取上、下相體積及總體積，按表二中所示的稀釋倍數取樣稀釋後，分別測其酶活。酶原液稀釋20倍測定。
3.酶活測定方法見後面附錄。
五、實驗記錄
表一、兩相圖製作：
注：其中帶有下劃線的部分為實驗過程中需要記錄的資料，其他為試驗後需計算整理的資料。其中第一次的5ml水即是最初加peg400後加入的5ml水。
表二、雙水相系統中蛋白質分配係數的測定
六、實驗結果：
1、雙水相圖：
2.雙水相系統中蛋白質分配係數的測定
其中：原液總酶活=上相酶活×上相體積+下相酶活×下相體積
相比表觀分配係數
收率經驗小結：
本次實驗讓我們收穫了很多的同時，也暴露出一些問題，我們組在此次試驗中的主要不足是，對雙水相萃取的原理步驟了解不夠，實驗過程中經常出現不知道下一步要怎麼做，做的時候要注意哪些問題等，以至於老是問別的組或者問學長該怎樣做，缺乏做實驗的主動性，影響了實驗的質量和速度，實驗前認真熟悉實驗原理和步驟是非常重要，這是我們應該注意的。
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