brucella abortus induces apoptosis of human t lymphocytes
摘要：免疫逃避是布魯氏菌在面對cd4+t細胞有效的適應性反應後在其內存活的必要條件。之前我們已經證明可以通過下調mhc-ⅱ分子的表達及巨噬細胞的抗原呈遞間接的抑制cd4 + t細胞。
然而，目前還不清楚是否能夠直接干擾t淋巴細胞。據報道，即使低水平的和非複製型的入侵t淋巴細胞，也能誘導人類t淋巴細胞的凋亡。滅活的也能產生同樣的現象，說明有乙個複雜的細菌的結構成分。
我們已證明，典型的外膜脂蛋白（l-omp19），而並非他的非脂化形式，能誘導人類t淋巴細胞的凋亡。此外，合成的脂己肽能模擬蛋白的脂質部分的結構也能誘導t淋巴細胞死亡的增加，這表明牽連到現象的結構部件可以是任何脂蛋白。誘導的t淋巴細胞的凋亡依賴於tnf-α的分泌，因為用抗tnf-α的單轉殖抗體預孵育的t淋巴細胞細胞的凋亡被抑制。
總體而言，這些結果說明了一種新機制，通過直接抑制t細胞介導的反應b. abortus可能逃避適應性免疫反應。
1.前言
布魯氏菌的感染已被證明能強而有效的啟用先天的免疫系統，能導致乙個前炎症反應，有利於t淋巴細胞分化th1。此反應是消除感染的關鍵。然而，布魯氏菌可以在巨噬細胞存活很多年，逃避宿主細胞介導的免疫反應並建立慢**染。
t細胞免疫應答的產生需要抗原呈遞細胞（apcs）的提呈和mhc 的基因表達。 mhc 分子在免疫應答中具有重要的生物學意義：一方面，mhc 分子直接參與抗原提呈細胞(apc) 對內源性或外源性抗原的提呈；另一方面，tcr (t細胞表面特異性識別受體) 在特異性識別 apc 所提呈的抗原肽過程中，必須同時識別與抗原肽結合成複合物的 mhc 分子，才能產生 t 細胞啟用訊號，即 mhc 限制性。
因此，為了逃避t淋巴細胞的應答反應，建立慢**染，布魯氏菌可能採用不同的方法。這種策略可以間接靶向apcs（例如：抗原呈遞受損），直接靶向t淋巴細胞，或者兩者都可以。
關於流產布魯氏菌是如何在巨噬細胞生存的，已經了解的很多。然而，流產布魯氏菌是以何種方式干擾適應性t細胞免疫還不完全了解。我們目前的研究已經證明，流產布魯氏菌感染人類單核細胞或巨噬細胞能抑制mhc-ii分子的表達和cd4+t淋巴細胞抗原的呈遞。
這種現象是由布魯氏菌脂蛋白引起的，依賴於toll樣受體2（tlr2），並受到白細胞介素-6（il-6）調節。同時，流產布魯氏菌的脂多醣（lps）通過在apcs的細胞膜上形成lps的微結構域破壞mhc-ii的遞呈途徑。布魯氏菌在巨噬細胞內長時間的生存和繁殖的機制說明，布魯氏菌能間接調節cd4 + t細胞的功能。
目前還不清楚流產布魯氏菌是否能夠直接干擾t淋巴細胞。本實驗室以前的研究結果已經證明，流產布魯氏菌感染個體在疾病的慢性期th1反應發生減弱。此外，還指出慢性布魯氏菌病患者外周血cd4+、cd8+淋巴細胞呈現出乙個減少的時期。
這些結果表明，流產布魯氏菌可以通過減少在慢**染的t淋巴細胞的數量限制t淋巴細胞反應。
近來病原體誘導t淋巴細胞凋亡受到很大的關注，因為它是乙個重要的免疫系統的調節機制，並涉及了感染性疾病在發展過程中效應功能的損失。某些微生物的病原體可能會提高他們在受感染的宿主內生存能力，使宿主細胞在防禦過程中致使細胞死亡，其中t淋巴細胞是乙個主要的靶細胞。因此，t淋巴細胞的凋亡在布魯氏菌的感染和生存的過程中發揮著重要的作用。
儘管布魯氏菌主要存在於巨噬細胞內，在細胞外的感染和傳播過程中也存在。因此，這些微生物會在他們的生活週期中直接與t淋巴細胞相互作用。
在這項研究中，我們研究流產布魯氏菌是否能直接影響t淋巴細胞的生存。此外，我們還研究了流產布魯氏菌的組成部分及其在這種現象中的相關作用機制。
2材料與方法
2.1 細菌的培養
流產布魯氏菌s2308細胞在10ml的胰蛋白酶大豆湯中37℃搖床培養過夜。4℃ 6000轉離心15min收菌，用10ml pbs洗兩次。與實驗室在600nm處的光密度的標準曲線相比較計算細菌的數量。
將培養物用pbs稀釋到所需的濃度，通過在胰酶大豆瓊脂糖培養基上塗板來測定接種物的濃度。為了獲得滅活的流產布魯氏菌，用無菌的pbs洗滌5次，每次10min，70度熱滅活20min，分裝，-70°c儲存備用。滅活後的流產布魯氏菌塗板驗證，沒有細菌生長。
所有活的布魯氏菌要在p3安全實驗室進行。
2.2轉殖，表達和純化重組l-omp19和u-omp19
如先前所述，轉殖和純化脂蛋白，為了消除lps造成的汙染，用瓊脂糖多粘菌素b吸附重組的外膜蛋白。用limulus amebocyte lysate鱟試劑是由海洋生物鱟的血液變形細胞溶解物製成的無菌冷凍乾燥品，含有能被微量細菌內毒素和真菌葡聚醣啟用的凝固酶原，凝固蛋白原，能夠準確、快速地定性或定量檢測樣品中是否含有細菌內毒素和（1,3）-β-葡聚醣激。目前，鱟試劑廣泛用於製藥、臨床以及科研等領域，用於細菌內毒素和真菌葡聚醣檢測。
目前使用的鱟試劑分為美洲鱟試劑和東方鱟試劑兩大類。 實驗檢測，這兩種蛋白所含內毒素均小於0.25u/ug。
bca法是近來廣為應用的蛋白定量方法。其原理與lowery法蛋白定量相似，即在鹼性環境下蛋白質與cu2+絡合併將cu2+還原成cu1+。bca與cu1+結合形成穩定的紫藍色複合物，在562 nm處有高的光吸收值並與蛋白質濃度成正比，據此可測定蛋白質濃度。
與lowery法相比，bca蛋白測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色複合物穩定性俱佳，並且受干擾物質影響小。與bradford法相比，bca法的顯著優點是不受去垢劑的影響。測定蛋白濃度，用牛血清白蛋白為標準。
將純化的蛋白分裝，-70°c儲存備用。
2.3 lps和脂肽
流產布魯氏菌s2308 lps由提供（納瓦拉大學，潘普洛納，西班牙）。該製劑的純度和特性在其他地方已經描述了。人工合成的脂己肽購自boehringer mannheim德國寶靈曼公司。
2.4細胞和培養基
所有的實驗均在rpmi1640培養基37度5%的co2。採集健康人的血液通過聚蔗糖-泛影葡胺（ge醫療）梯度離心分離外周血單核細胞（pbmcs）。t淋巴細胞從外周血單核細胞分離得到，使用cd3+ cd4+和cd8+t淋巴細胞負分離試劑盒，按照操作說明進行分離。
通過流式細胞儀驗證分離純化的cd3+ cd4+和cd8+t的濃度分別大於98%，90%和78%。thp-1細胞從美國典型培養物保藏中心獲得的，並如前面所述培養。通過臺酚藍排斥實驗測定，細胞的存活率為95%以上。
2.5體外感染
用流產布魯氏菌以不同方法多重感染thp-1細胞或t細胞並在不含抗生素的培養基上培養2h。然後將細胞充分的洗滌以除去外面的細菌，感染的細胞應在含100微克/毫公升慶大黴素和50微克/毫公升鏈黴素的條件下培養以便殺死殘留的胞外菌。在不同的時間感染後，在處理之前用pbs將細胞洗滌3次。
為了檢測布魯氏菌在細胞內的生存，用0.1%的triton x-100(聚乙二醇辛基苯基醚)裂解感染的細胞，然後用pbs洗滌稀釋後在蛋白腖大豆瓊脂糖培養基上培養cfu計數。
2.6細胞凋亡檢測
用布魯氏菌以不同的moi :multiplicity of infection，感染複數。傳統的moi概念起源於噬菌體感染細菌的研究。
其含義是感染時噬菌體與細菌的數量比值，也就是平均每個細菌感染噬菌體的數量。噬菌體的數量單位為pfu（plaque forming unit，空斑形成單位）。一般認為moi是乙個比值，沒有單位，其實其隱含的單位是pfu number/cell。
後來moi被普遍用於病毒感染細胞的研究中，含義是感染時病毒與細胞數量的比值感染t淋巴細胞或者用hkba, l-omp19,u-omp19, pam3cys刺激並在特定的濃度下培養24h，48h或者6天。然後，洗滌細胞並用膜聯蛋白v-fitc（bd biosciences公司）和碘化丙啶（pi;bd biosciences公司在冰上避光孵育10分鐘。通過facscalibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率和使用flowjo軟體處理資料。
annexin v的陽性細胞被認為是細胞凋亡。通過流式細胞儀用fragel 螢光檢測試劑盒tunel法進行檢測細胞凋亡。將t淋巴細胞接種於培養皿中密度為每孔1.
5×105用hoechst 33,3 42燃料染色培養48小時後可用螢光顯微鏡觀察凋亡細胞。標記的細胞可通過螢光顯微鏡分析。
2.7流式細胞技術fcm
為了描述t淋巴細胞的表型特徵，用pe標記的抗人cd8單轉殖抗體，fitc標記的抗人cd4單轉殖抗體，percp標記的抗人cd3單轉殖抗體或者同型別的抗體進行染色。標記後，用facscalibur流式細胞儀進行細胞分析並用flowjo軟體處理資料。
2.8前列腺素的產生
放射免疫法（ria）是用來檢測上清中peg2的水平的。簡單的說，就是用抗血清在4度孵育30min。加入標記物後4度培養60min。
再加入活性炭：葡聚醣(1%: 0.
1%)溶液4度孵育10min。離心15分鐘，用液體閃爍計數儀測定上清中氚的活性。
2.9抑制pge2的產生
在用100um吲哚美辛存在或缺乏的的條件下用流產布魯氏菌感染t淋巴細胞48小時。然後，用annexin v/pi檢測細胞凋亡。
2.10細胞因子的產生
使用eli sa法檢測上清中人類tnf-a的濃度。
2.11抑制可溶性tnf-a的產生
用人類的tnf-α孵育t淋巴細胞30分鐘中和單轉殖抗體或者同型別分別做對照。然後用l -omp19培養48小時，用annexin v/pi進行細胞凋亡檢測分析。
2.12統計分析
試驗結果用單因素或雙因素方差分析，用graphpad prism軟體進行邦弗朗尼（bonferroni）事後檢定/檢驗。資料表示為平均值+標準差或標準誤。
3 結果
3.1 流產布魯氏菌能感染t淋巴細胞但不複製
流產布魯氏菌寄生於巨噬細胞，會採用不同的免疫逃避策略。為了研究流產布魯氏菌採用的這些策略是否也使用於其他的免疫細胞，我們決定**其對t淋巴細胞的影響。我們首先要確定流產布魯氏菌感染t淋巴細胞的能力。
高度純化從人體外周血單核細胞負篩選的t淋巴細胞。通過流式細胞儀檢測分離純化的cd3的結果到達98%以上。(圖1a和b)。
用流產布魯氏菌2308菌株以不同的感染複數去侵染純化的t淋巴細胞。用thp-1單核細胞系作為對照，眾所周知，它也能被布魯氏菌感染並在胞內複製。如圖1c所示，即使流產布魯氏菌侵入t淋巴細胞的細菌數大大低於thp-1細胞，然而，動力學分析，我們觀察到流產布魯氏菌不能夠在t淋巴細胞內複製（圖1d）,這個結果表明b.
abortus能夠感染t淋巴細胞，但是，這些細胞不能為細菌提供複製的場所。
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