andy (2010-09-13 16:08:20)
作者：張宇，張勇，楊長成，王振寧作者單位：1.
中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤外科，遼寧瀋陽 110001；中國醫科大學附屬第一醫院普通外科教研室胃腸腫瘤外科，遼寧瀋陽 110001； 2.瀋陽市肛腸醫院**病科，遼寧瀋陽 110002
【摘要】 microrna（mirna）是一類新發現的非編碼、內源性小rna分子，通過與靶基因mrna結合參與多種基因的表達調控。mirna表達的檢測技術主要以雜交和反轉錄聚合酶鏈反應（rt pcr）為主。近年來，這些技術不斷得到改進,例如，rna加尾和引物延伸在rt pcr技術中的應用，為深入研究mirna功能提供了有力的工具。
現對檢測mirna表達的相關技術進展加以綜述。
【關鍵詞】 mirna；表達調控；檢測技術
microrna（mirna）是一類非編碼、內源性的小rna，長約21～25核苷酸（nucleotides，nt）。經**，人類基因組編碼了超過1 000種不同的mirna［1］。近年來國內外研究已經在動植物體內證實了數百種mirna［2］，並確定了少數mirna的功能，但大部分mirna的功能尚不清楚［3］。
解決這一問題的首要環節是找出各mirna在組織或細胞中表達的組織和時序特異性。自2023年首次發現mirna以來，檢測其表達水平的技術方法迅速發展，雖然傳統方法如northern雜交技術等仍在mirna表達檢測中起著重要作用，但許多針對mirna檢測的新技術方法不斷湧現，為深入研究mirna提供了更多的幫助。在此，作者對傳統及最新發展的mirna表達檢測方法作一簡要綜述，以期對mirna研究提供一些思路和啟發。
1 mirna簡介
2023年，lee等［4］在對線蟲的研究中發現了首個mirna lin 4，當時有研究指出lin 4可以抑制lin 14蛋白表達，但機制不清。直至2023年，發現第2個mirna let 7［5］及其在人類和果蠅中同源體後，人們逐漸認識到mirna是一類進化保守，在生物進化［6］和疾病發展過程中起著調控作用的重要分子，通過抑制靶基因的表達產生基因沉默效應［7 8］。越來越多的mirna得到鑑定，目前估計人類mirna總數在800種以上，是最初**mirna種類的3倍以上［9］。
mirna生物合成是乙個複雜的過程，首先在細胞核內由mirna基因轉錄產生pri mirna，pri mirna經drosha切割作用釋放出長約70 nt的莖環結構—pre mirna［10］；pre mirna轉運至細胞質後經過酶的修飾作用形成成熟的mirna。mirna與rnase、解螺旋酶等活性分子構成rna誘導沉默複合體(rna induced silencing complex,risc)。risc通過特異地錨定在靶mrna上介導目的mrna的切割或翻譯抑制，從而調控目的基因的表達。
2 mirna檢測技術
2.1 northern雜交
northern雜交是檢測mirna表達的一種簡便而可靠方法［11］，不僅用於檢測mirna在組織細胞中的表達水平，而且結合rna marker，可經凝膠電泳檢測mirna的分子大小。
2023年始，northern雜交應用於mirna表達譜研究，也是首個用於半定量檢測mirna的實驗技術，通過將已知濃度梯度的寡核苷酸參照物與待測樣品進行平行雜交，實現對mirna的半定量檢測［12］。而後，northern雜交成為檢測細胞中mirna表達的常規研究方法之一。haya****a等［13］用該技術比較正常細胞和肺癌細胞中的表達情況，發現mir 17 92在肺癌中的表達明顯公升高。
sempere等［11］用該技術檢測了已知的119個mirna表達譜，發現一部分在特異組織中表達,一部分無特異性，且在不同組織中表達水平各異。
northern雜交最大的缺點是對樣品的需求量較高，需要微克級樣品才能避免假陰性，有時樣品量達到40 μg才會出現明顯雜交訊號。
2.2 原位雜交
原位雜交分為細胞和組織內原位雜交，該技術檢測mirna表達，可更直觀的展示出mirna的時空表達模式。80年代後期可在****固定、石蠟包埋的組織中進行原位雜交，近年來擴充套件到細胞及亞細胞水平進行mirna的檢測［10］。該技術不僅可以檢測不同細胞系單個細胞中的mirna表達，還可在不經分類和分離的情況下，比較不同細胞系中mirna的表達水平。
wienholds等［14］首次將lna探針（locked nucleic acid modified probe，lna）用於原位雜交技術，檢測了斑馬魚（zebrafish）100餘種mirna的空間表達模式。他們用相同的技術觀察了115種在脊椎動物中表達保守的mirna表達譜，又用基因晶元技術檢測了相同的mirna在斑馬魚胚胎不同發育階段的表達譜，並將二者加以對比。隨後kloosterman等［15］對該技術的重要引數進行優化，使之逐漸成為分析mirna表達組織和時序特異性的有力工具。
2.3 基因晶元
基因晶元技術可以高通量的檢測基因表達譜。最初的mirna基因晶元，是將反義dna探針點在尼龍膜上，然後以5′端放射性標記的mirna樣品雜交，再經放射自顯影獲得訊號［16］。
至今，很多研究應用該技術建立了不同物種不同組織中mirna的表達譜，亦有研究比較了正常組織和和疾病組織中mirna表達譜的差異。liu等［17］用晶元技術檢測了mirna在不同腫瘤細胞中的表達譜，均經northern雜交、rt pcr證實。calin等［18］用該技術比較了哺乳動物中b細胞淋巴瘤和正常組織中mirna的表達譜，為mirna在腫瘤臨床診治中的應用提出了新思路。
murakami等［19］用該技術比較肝癌組織和鄰近非腫瘤組織mirnas表達譜，發現mir 18和mir 224在肝癌組織中的表達明顯上調，而mir 199a、 mir 195a、mir 200a和mir 125a在肝癌組織中的表達明顯下降。在晶元的基礎上，nelson等［20］提出一種稱為rake（rna primed,array based klenow)的方法，在特定的細胞中同時檢測所有mirna的表達譜，並且能夠檢測出****固定、石蠟包埋組織中的mirna表達譜，使分析儲存標本中的mirna表達譜成為可能。
儘管基因晶元技術敏感度有了很大提高，且可用於多個mirna同時檢測，但仍有不足：基因晶元的製作和檢測需要昂貴的儀器裝置；結果是半定量的，重複性較差；不能同時優化所有待測mirna的雜交環境，因而不能區分高度類似的mirna，等等。鎖定的核苷酸修飾探針（locked nucleic acid modified probe）［21］在基因晶元技術的應用，可能會進一步較精確地區分高同源性mirna的表達差異。
2.4 反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，rt pcr）
2.4.1 半定量rt pcr
rt pcr作為半定量或定量檢測mirna表達的常用實驗方法，在研究mirna表達的過程中不斷得到改進。半定量rt pcr是常用的一種簡潔、快速、特異的相對定量的rna檢測技術，只能測定mirna的相對含量，有研究用該技術成功對比了待測和對照樣本之間特異mirna的表達差異。akao等［22 23］用該技術研究發現，mir 143、mir 145和mirlet 7在結腸癌組織中的表達水平明顯低於相應的正常組織。
後來有研究對半定量rt pcr加以改進:（1）rna加尾rt pcr：rna加尾rt pcr是在傳統rt pcr的基礎上發展而來，可用於半定量或定量檢測mirna的表達,結果與northern雜交一致。
該技術有以下優點：可在較短時間內獲得結果；高通量，可同時檢測多種mirna的表達；與northern雜交相比，僅需少量rna，且不用放射性同位素標記；可同時檢測到成熟mirna及其對應的pre mirna；操作過程簡單。該技術檢測mirna表達時需注意以下問題：
有的mirna和其他mirna具有同源區域，它們的引物序列就是mirna基因序列5′端的一部分，因而要確保引物3′端的不同；退火溫度是保證高度特異擴增的關鍵因素，有研究提出，較高的退火溫度(60 ℃～61 ℃)可提高反應的特異性［24］；與用總rna相比，使用從低分子量rna中富集的mirna可提高該技術的敏感性。fu等［24］用該技術檢測了mir 19b、mir 27a等mirna，結果與northern blot雜交一致。（2）引物延伸rt pcr：
引物延伸rt pcr既可檢測成熟的mirna，也可檢測單個mirna和sirna。zeng等［25］通過引物延伸並用放射性帶移法（radioactive band shift assay）檢測了成熟mir 30、mir 21的表達水平。後經改進把引物延伸用於實時rt pcr 定量檢測mirna的表達，包括以下步驟：
用加尾的特異引物把mirna反轉錄為cdna，在cdna的一端引入1個結合位點延長長度；實時定量pcr檢測。
2.4.2 實時定量rt pcr
實時定量rt pcr可用於檢測mirna在腫瘤中的表達水平。schmittgen等［26］用實時定量rt pcr成功檢測到23種mirna前體在人類6種不同癌細胞系中的表達水平。2023年，jiang等［27］用該技術檢測222種mirna在不同腫瘤細胞系中的表達情況，發現在一些腫瘤中確有特異性的mirna存在。
lee等［28］用同樣的方法發現mir 221、mir 376和mir 301在胰腺癌中顯著高表達。但是傳統實時定量rt pcr只能檢測到mirna前體，為了解決這一問題，後來的研究者提出了step loop實時定量rt pcr技術。
step loop實時定量rt pcr是一項高特異度、敏感度的檢測mirna表達的實驗技術，包括設計具有莖環（stem loop）結構的反轉錄引物和用mirna螢光標記的特異分子探針進行實時pcr 2個關鍵步驟［29］。該技術有以下優點：高度特異性，特異的step loop 反轉錄引物和探針確保反應不受其前體及基因組dna汙染等因素的干擾，對序列高度同源的mirna也可精確區分；超寬的定量線性範圍和高度的檢測靈敏度，從幾個拷貝到幾萬個拷貝，定量線性範圍跨越7個數量級；樣品消耗少，僅需1～10 ng的總rna；適用範圍廣，總rna 、細胞裂解物以及純化的rna都可用於mirna的定量檢測，也可用於其他小分子rna的檢測，如sirna。
但是該技術需要較昂貴的實驗材料及儀器。zhang等［29］用該技術檢測32例胃癌標本中mir let 7a的表達水平，發現其在14例的癌組織中比相應正常組織的表達水平明顯降低。chen等［30］亦用同樣的方法比較了5種mirna在小鼠7種不同組織的表達差異。
shi等［31］把rna加尾和引物延伸用於實時定量rt pcr，成功檢測了植物中mirna表達。張旂等［32］用同樣的方法對15種mirna在大鼠心、肝和大腦皮層的表達進行檢測，驗證了該技術的可靠性。
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