實驗七高效液相色譜(hplc)法測定鄰苯二甲酸酯
一. 實驗目的
1、學習高效液相色譜儀的基本操作方法。
2、了解高效液相色譜儀原理和條件設定方法。
3、了解高效液相色譜法在日常分析中的應用。
二. 實驗原理
高效液相色譜法是以液體作為流動相，借助於高壓輸液幫浦獲得相對較高流速的液流以提高分離速度、並採用顆粒極細的高效固定相製成的色譜柱進行分離和分析的一種色譜方法。
在高效液相色譜中，若採用非極性固定相，如十八烷基鍵合相，極性流動相，即構成反相色譜分離系統。反之，則稱為正相色譜分離系統。反相色譜系統所使用的流動相成本較低，應用也更為廣泛。
定量分析時，為便於準確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度（r）的計算公式為：
r＝ 2[t(r2)-t(r1)] /1.7*(w1＋w2)
式中 t(r2)為相鄰兩峰中後一峰的保留時間； t(r1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； w1及w2為此相鄰兩峰的半峰寬。 除另外有規定外，分離度應大於1.5。
本實驗物件為鄰苯二甲酸酯，又稱酞酸酯，縮寫pae，常被用作塑料增塑劑。它被普遍應用於玩具、食品包裝材料、醫用血袋和膠管、乙烯地板和桌布、清潔劑、潤滑油、個人護理用品，如指甲油、頭髮噴霧劑、香皂和洗髮液等數百種產品中。 但研究表明，鄰苯二甲酸酯在人體和動物體內發揮著類似雌性激素的作用，是一類內分泌干擾物。
待測物性質見表1。
表1色譜柱測試條件
如果要檢測不同條件對譜圖分離的影響，可按表1配製幾種物質的混合溶液，在不同條件下進行hplc分離檢測。
三.儀器與試劑
1、儀器
agilent 1100高效液相色譜儀，50ul微量注射器。
2、試劑
甲醇（色譜專用），高純水
四. 實驗步驟
1、色譜條件
色譜柱：辛烷基矽烷鍵合矽膠（c8）
柱溫：室溫
流動相：初始為高純水：30％，甲醇：70％
檢測器：dad檢測器;
檢測波長：220nm；
進樣體積：100l定量環，實際注射每次可控制在200l。
2、待測溶液的配製
首先用甲醇做溶劑配製儲備液：鄰苯二甲酸二甲酯（0.3880g/l），鄰苯二甲酸二乙酯（0.
2770g/l），鄰苯二甲酸二丁酯（0.3776g/l）。然後各取1ml儲備液用水和甲醇（20：
80）稀釋至10ml，作為待測溶液。
3、色譜測定
(1) 按操作規程開啟電腦，開啟脫氣機、幫浦、檢測器等的電源，啟動agilent 1100**工作軟體，設定操作條件。流量為1.000ml/min。
(2) 待儀器穩定後，開始進樣。將進樣閥柄置於「load」位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入儀器進樣口，順時針方向扳動進樣閥至「inject」位置，此時顯示屏顯示進樣標誌。
(3) 記下各組分色譜峰的保留時間及峰面積及分離比。
(4) 實驗完畢，清洗系統及色譜柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到純甲醇作流動相清洗，每次清洗至基線走穩，至少清洗15min。
五.實驗結果
（1）流動相的比例為：高純水：20%甲醇：80%，流速為1.0ml/min，記錄色譜圖，並計算分離度；
根據分離度公式：計算分離度：r1==2.466，r2==13.92
（2）流動相的比例為：高純水：20% 甲醇：80%；流速為0.5ml/min，記錄色譜圖，並計算分離度；
根據分離度公式：計算分離度：r1==3.136，r2==17.29
（3）流動相的比例為：高純水：30％，甲醇：70％，流速為1.0ml/min，記錄色譜圖，並計算分離度；
根據分離度公式：計算分離度：r1==5.991，r2==37.65
（4）定性過程（混合物和dep）：實驗得到如下的色譜圖下：
由圖可以看出，混合溶液的出峰順序為：鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯。
六. 思考題
（1） 比較圖2和圖3可知，在緩衝液作流動相的情況下，實驗得出的峰形較好。但為什麼實驗室盡量不用緩衝溶液作流動相？
圖2 緩衝液作流動相得出的色譜圖
圖3 乙腈-水（5：95）作流動相得出的色譜圖
答：因為緩衝溶液對色譜柱的損傷較大，使用後，不易清洗，成本高，並且這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復的。
（2）流動相在使用前為什麼要用砂芯漏斗過濾？
答：hplc要求流動相非常的純淨，否則他會對色譜柱和儀器產生不可逆損壞。由於色譜柱填料顆粒很細，內腔很小，流動相中的細小顆粒會使色譜柱和毛細管堵塞；而儀器進樣閥也易被小顆粒堵塞，因此流動相在使用前要用砂芯漏斗過濾。
（3） 請分析實驗結束後，怎樣清洗柱子。分為兩種情況，第一種情況為流動相用到緩衝溶液，第二種情況為流動相不用緩衝溶液？
答：分析實驗結束後，先將體系中鹽分去除乾淨，再依次用甲醇：水（60：40）、甲醇：水（70：30）……直到純甲醇作流動相清洗清洗柱子，並最後灌滿。
（4）根據實驗結果分析，流動相中水的比例多少對分離度、出峰時間的影響及流速對分離度的影響。
答：根據實驗結，可以看出，流動相中水的比例越高（或甲醇比例越低），流速越小，分離度越高，出峰時間越晚；水的比例減小，分離度也減小，但出峰時間加快。所以應選擇乙個合適的流動相比例。
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