高效液相色譜
我國藥典收載高效液相色譜法專案和數量比較表：
鑑於hplc應用在藥品分析中越來越多，因此每乙個藥品分析人員應該掌握並應用hplc。
i．概論 2
一、液相色譜理論發展簡況 2
二、hplc的特點和優點 2
三、色譜法分類 3
四、色譜分離原理 3
ii．基本概念和理論 5
一、基本概念和術語 5
二、塔板理論 8
三、速率理論（又稱隨機模型理論） 9
iii．hplc系統 10
一、輸液幫浦 11
二、進樣器 13
三、色譜柱 14
四、檢測器 17
五、資料處理和計算機控制系統 20
六、恆溫裝置 20
iv．固定相和流動相 20
一、基質（擔體） 20
二、化學鍵合固定相 22
三、流動相 23
1．流動相的性質要求 23
2．流動相的選擇 24
3．流動相的ph值 24
4．流動相的脫氣 25
5．流動相的濾過 25
6．流動相的貯存 26
7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題 26
8．hplc用水 26
v．hplc應用 27
一、樣品測定 27
二、方法研究 27
附件：高效液相色譜法（hplc）複核細則 28
一、對起草單位的要求： 28
二、對複核單位的要求： 28
i．概論
一、液相色譜理論發展簡況
色譜法的分離原理是：溶於流動相(mobile phase)中的各組分經過固定相時，由於與固定相(stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先後從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。
色譜法最早是由**植物學家茨維特（tswett）在2023年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的，色譜法(chromatography)因之得名。後來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。
液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，hplc)是在經典液相色譜法的基礎上，於60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(high pressure liquid chromatography，hplc)。
又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(high speed liquid chromatography，hslp)。也稱現代液相色譜。
二、hplc的特點和優點
hplc有以下特點：
高壓——壓力可達150~300 kg/cm2。色譜柱每公尺降壓為75 kg/cm2以上。
高速——流速為0.1~10.0 ml/min。
高效——可達5000塔板每公尺。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
hplc與經典液相色譜相比有以下優點：
速度快——通常分析乙個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。
解析度高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，螢光和電化學檢測器可達0.1pg。
柱子可反覆使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易**——樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做製備。
三、色譜法分類
按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(gc)和液相色譜法(lc)。氣相色譜法適用於分離揮發性化合物。
gc根據固定相不同又可分為氣固色譜法(gsc)和氣液色譜法(glc)，其中以glc應用最廣。液相色譜法適用於分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。lc同樣可分為液固色譜法(lsc)和液液色譜法(llc)。
此外還有超臨界流體色譜法(sfc)，它以超臨界流體（界於氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用co2），因其擴散係數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用於手性化合物的拆分。
按原理分為吸附色譜法(ac)、分配色譜法(dc)、離子交換色譜法(iec)、排阻色譜法(ec，又稱分子篩、凝膠過濾(gfc)、凝膠滲透色譜法(gpc）和親和色譜法。（此外還有電泳。）
按操作形式可分為紙色譜法(pc)、薄層色譜法(tlc)、柱色譜法。
四、色譜分離原理
高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是乙個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為矽膠或氧化鋁，粒度5~10μm。
適用於分離分子量200~1000的組分，大多數用於非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用於分離同分異構體。
2．液液色譜法使用將特定的液態物質塗於擔體表面，或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是乙個分配平衡過程。
塗佈式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集複雜化。由於塗佈式固定相很難避免固定液流失，現在已很少採用。現在多採用的是化學鍵合固定相，如c18、c8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(npc)和反相色譜法(rpc)。
正相色譜法採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法一般用非極性固定相（如c18、c8）；流動相為水或緩衝液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。rpc在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它佔整個hplc應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用範圍逐漸擴大，現已應用於某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩衝液控制流動相的ph值。但需要注意的是，c18和c8使用的ph值通常為2.
5~7.5（2~8），太高的ph值會使矽膠溶解，太低的ph值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在ph 1.
5~10範圍操作。
正相色譜法與反相色譜法比較表
從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩衝液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的ph值和離子強度影響。ph值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。
流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利於樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用於分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物後，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用於分析離子強度大的酸鹼物質。
分析鹼性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種鹼性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ods柱（即c18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/l的離子對試劑，在一定的ph值範圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其ph值、離子強度有關。
高效液相色譜實驗報告
4 檢測系統 hplc檢測器分為通用型檢測器和專用型檢測器兩類。通用型檢測器可連續測量色譜柱流出物 包括流動相和樣品組分 的全部特性變化。這類檢測儀器包括示差折光檢測器 介電常數檢測器 電導檢測器和磁光旋轉檢測器。這類檢測器適用範圍廣，但是對於流動相有響應，受溫度變化 流動相流速和組成變化的影響，檢...
高效液相色譜解決方法
一 為了延長hplc液相幫浦的使用壽命和維持其輸液的穩定性請按照以下注意事項操作 1 防止任何固體微粒進入hplc液相幫浦體，因為塵埃或其它任何雜質都會磨損hplc液相柱塞 hplc密封環 hplc液相缸體和hplc液相單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內蒸餾，而常用...
高效液相操作規程
1 開啟系統各模組電源，待系統自檢結束。2 開啟電腦，雙擊桌面上工作站圖示，進入主選單，再點選分析圖示，進入實時分析介面。這是可以聽到 嘀 的聲音，表示聯機正常。3 開啟排氣閥，按下幫浦面板上的purge鍵，對系統管路進行排氣。4 點選助手欄中的資料採集圖示，再點選儀器引數，按照具體分析條件設定好儀...