細胞傳代培養（消化法）標準操作規程
一、原理
細胞在培養瓶長成緻密單層後，已基本上飽和，為使細胞能繼續生長，同時也將細胞數量擴大，就必須進行傳代（再培養）。
傳代培養也是一種將細胞種儲存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化後才能分瓶。
二、材料和試劑
1. 無菌磷酸生理緩衝液(pbs)
2. 胰酶-edta溶液(0.05%胰酶-0.53mm edta-4na): 以10ml分裝於15 ml無菌離心管中，儲存於–20℃，使用前放在37℃ 水槽回溫。
3. 新鮮培養基
4. 無菌吸管/離心管/培養瓶
三、操作步驟
1. 傳代前準備
（1）預熱培養用液：把已經配製好的裝有培養液、pbs液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。
（2）用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超淨工作台和雙手。
（3）正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便於操作而且可減少汙染。
（4）點燃酒精燈：注意火焰不能太小。
（5）準備好將要使用的消毒後的空培養瓶。
（6）取出預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好後方能放入超淨台內。
（7）從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的檯面，再在鏡下觀察細胞。
（8）開啟瓶口：將各瓶口一一開啟，同時要在酒精燈上燒口消毒。
2. 胰蛋白酶消化
（1）加入消化液：小心吸出舊培養液，用pbs清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37℃。
（2）顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連線成片，表明此時細胞消化適度。
（3）吸棄消化液加入培養液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養液。
3. 吹打分散細胞
（1）吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。
（2）吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。
（3）平衡離心：平衡後將離心管放入台式離心機中，以1000轉/分鐘離心6-8分鐘。
（4）棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞製成細胞懸液。
4. 分裝稀釋細胞
（1）顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低於5×105/ml。最後要做好標記。
（2）分裝：將細胞懸液吸出分裝至2～3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。
（3）繼續培養：用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋鬆瓶蓋，放入co2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時後開始貼附在瓶壁上。
5. 懸浮型細胞的傳代
（1）吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。
（2）吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混和均勻後，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。
注意事項：
1.嚴格的無菌操作。
2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配製時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連線變鬆散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
附：edta（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：
edta 0.20g，nacl 8.00g， kcl 0.
20g， kh2po4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.
5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時調節ph值到7.4。
注意edta不能被血清中和，使用後培養瓶要徹底清洗，否則再培養時細胞容易脫壁。
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百利藥業生物藥研發部 標準操作規程 題目 293t細胞傳代培養操作規程 編號 sop m e 003 制定者簽名 日期 年月日 批准者簽名 日期 年月日 生效日期年月日 修改和追加記錄 題目 293t細胞培養操作規程 1 目的 293t細胞是常用於包裝和擴增病毒載體的工具細胞，因此做好293t細胞的...
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背景知識 細胞培養的傳代及日常維持過程中，在培養器具 培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開活體開始原代培養，它的各種生物特性都將逐漸發生變化並隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在 70 冰箱中可以儲存一年之久 細胞儲...