分子生物學實驗講義
（碩士研究生試用）
山西醫科大學
基礎醫學院
生物化學與分子生物學實驗室
2011.5
實驗一動物組織蛋白質的提取
【目的要求】
1．掌握動物組織蛋白質的提取方法。
2．了解動物組織蛋白質提取的原理。
【實驗原理】
由於蛋白質種類很多，性質上的差異很大，即或是同類蛋白質，因選用材料不同，使用方法差別也很大，且又處於不同的體系中，因此不可能有乙個固定的程式適用各類蛋白質的分離。但多數分離工作中的關鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質均可溶於水、稀鹽、稀酸或稀鹼溶液中，少數與脂類結合的蛋白質溶於乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中。因此可採用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質。
蛋白質在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決於蛋白分子中非極性疏水基團與極性親水基團的比例，其次取決於這些基團的排列和偶極矩。故分子結構性質是不同蛋白質溶解差異的內因。溫度、ph、離子強度等是影響蛋白質溶解度的外界條件。
提取蛋白質時常根據這些內外因素綜合加以利用，將細胞內蛋白質提取出來，並與其它不需要的物質分開。但動物材料中的蛋白質有些以可溶性的形式存在於體液（如血漿、消化液等）中，可以不必經過提取直接進行分離。蛋白質中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質，只需要適當的溶劑洗去可溶性的伴隨物，如脂類、醣類以及其他可溶性蛋白質，最後剩下的就是不溶性蛋白質。
蛋白質經細胞破碎後，用水、稀鹽酸及緩衝液等適當溶劑，將蛋白質溶解出來，再用離心法除去不溶物，即得粗提取液。
【試劑器材】
1． 實驗小鼠
2． 0.9%nacl
3． 動物組織蛋白裂解緩衝液
tris 三羥甲基氨基甲烷50mm tris是一種最常用的生物緩衝液，常配成ph值為6.8，7.4，8.
0，8.8。其ph值隨溫度變化很大。
一般來說，溫度每公升高一度，ph值下降0.03。
nacl 150mm
edta 乙二胺四乙酸 0.5mm edta是化學中一種良好的配合劑，它有六個配位原子，形成的配合物叫做鰲合物，edta在配位滴定中經常用到，一般是測定金屬離子的含量。
dtt 二氯二苯三氯乙烷 1mm 不溶於水，溶於煤油，可製成乳劑，是有效的殺蟲劑環境中非常難降解
triton x-100 1% triton x-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 是一種非離子型表面活性劑（或稱去汙劑）。它能溶解脂質，以增加抗體對細胞膜的通透性
去氧膽酸鈉 0.5% 產品性狀: 白色結晶性粉末。
類似膽汁氣味。有強烈苦味。易吸濕。
易溶於水，微溶於無水醇，不溶於醚。比旋光度約+42.5(c=2,水中)。
配製細菌培養基，代替腦磷脂作膽固醇絮狀試驗，蛋白質分析。
sds 十二烷基硫酸鈉 0.1% 是一種白色或淡黃色微粘物，工業上常用於洗滌劑和紡織工業。屬陰離子表面活性劑。
易溶於水，與陰離子、非離子復配伍性好，具有良好的乳化、發泡、滲透、去汙和分散效能，廣泛用於牙膏、香波、洗髮膏、洗髮香波、洗衣粉、液洗、化妝品和塑料脫模，潤滑以及製藥、造紙、建材、化工等行業
4． pmsf/異丙醇儲備液 100mm（174mg/10ml）於-20℃儲存
5． -20℃儲存的冰塊
【操作步驟】
1. 頸椎脫臼處死小鼠，75%酒精擦拭**，剪開腹部，剪下肝臟組織，稱取0.6g，置於含預冷0.9%nacl（6ml）的平皿中。
2. 在平皿中剪碎肝臟組織，並轉移到勻漿器中。
3. 在預冷的裂解緩衝液中新增pmsf/異丙醇儲備液（20l/2ml）。(抑制絲氨酸蛋白酶)
4. 迅速將2ml 預冷的裂解緩衝液加入勻漿器中，冰浴條件下充分研磨。
5. 將組織研磨液轉移到1.5ml的離心管中，於4℃離心（1 4000rpm，10min）。
6. 離心完畢吸取上清液轉移至一新的1.5ml離心管中，即為組織蛋白粗提取液。
7. 所獲蛋白提取液可儲存於-20℃用於後續實驗或用考馬斯亮藍等方法進行蛋白質濃度測定後儲存備用。
【注意事項】
在整個製備過程中使組織始終處於冰浴狀態，以防蛋白質的降解。
實驗二蛋白質的定量（bradford法）
【目的要求】
掌握考馬斯亮藍(coomassie brilliant blue)法測定蛋白質含量的原理和方法。
【實驗原理】
考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度是利用蛋白質與染料結合的原理，定量測定微量蛋白質濃度，具有快速、靈敏的特點。
考馬斯亮藍g-250存在兩種不同的顏色形式：紅色和藍色。當染料與蛋白質結合後由紅色轉變成藍色形式。
蛋白質與g250的結合是通過范德華力實現的，並且在一定濃度範圍內二者的結合顯色符合朗伯-比爾定律(又稱比爾定律、比耳定律、朗伯-比爾定律、布格-朗伯-比爾定律（bouguer–lambert–beer law），是光吸收的基本定律，適用於所有的電磁輻射和所有的吸光物質，包括氣體、固體、液體、分子、原子和離子)。結合後的產物在595nm處具有最大吸收峰，通過對溶液的光吸收測定可獲得與其結合蛋白質的量。
【試劑器材】
1. 考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍g-250 100mg溶於25ml甲醇中，加入800 ml蒸餾水，再加入 100 ml 85％磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過濾。
2. 標準蛋白質溶液（1mg /ml）：牛血清白蛋白100mg，加0.9％nacl至100 ml。
3. 試管及試管架，吸管。
4. 比色計。
【操作步驟】
一、 標準曲線的製備：取5支試管，編號，按下錶操作
編號1號液 2號液 3號液 4號液 5號液
標準蛋白質溶液（ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
（1mg /ml）
0.9％nacl（ml0.8 0.6 0.4 0.2 －
蛋白質濃度200 400 600 800 1000
（μg /ml）
另取6支試管，編號為0～5，按下錶操作
編號0 1 2 3 4 5
1號液 2號液 3號液 4號液 5號液
不同濃度蛋白質溶液（ml0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
0.9％nacl（ml0.1
考馬斯亮藍試劑（ml） 5 5 5 5 5 5
蛋白質含量（μg0 20 40 60 80 100
混勻各管，室溫下靜置10分鐘，於595 nm處進行比色。
二、 繪製標準曲線：以a 595 nm為縱座標，標準蛋白質含量為橫座標，在座標紙上繪製標準曲線。
三、 測定未知樣品蛋白質濃度：
測定方法同上，取適量未知樣品，使其測定值在標準曲線的直線範圍內。根據所測定的a 595 nm值，在標準曲線上查出其相當於標準蛋白質的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度。
【注意事項】
1． 在考馬斯亮藍試劑加入後的5－20分鐘內測定光吸收，因為在此段時間內顏色最穩定。
2． 測定中，蛋白—染料複合物會有少量吸附於比色杯壁上，實驗證明此複合物的吸附量是可以忽略的，測定後可用乙醇將比色杯洗乾淨。
實驗三 sds-聚丙烯醯胺凝膠電泳
【目的要求】
1.了解並掌握sds-page電泳原理及方法。
2.掌握垂直板電泳的操作方法。
【實驗原理】
十二烷基硫酸鈉（sds）—聚丙烯醯胺凝膠（page）電泳可根據蛋白質分子大小的差別分離蛋白質，並可測定蛋白質的相對分子量，其原理主要與電泳過程中存在的特殊物理效應有關：
1．凝膠的分子篩效應：聚丙烯醯胺凝膠是在催化劑的作用下聚合而成的具有網狀立體結構的微孔凝膠，蛋白質顆粒在電場中通過此凝膠時，會受到阻礙。大分子蛋白質受到的阻力大，電泳速度小，而小分子蛋白質受到的阻力小，移動快，因而最終在凝膠中得以分離。
2．電荷效應：sds是一種表面活性劑，在蛋白樣品和page凝膠中加入sds，則能與蛋白質分子上的疏水基團結合，使蛋白質表面覆蓋一層sds分子。由於十二烷基硫酸根帶有大量負電荷，且電荷量遠遠超過蛋白質分子原有的帶電量，因而掩蓋了蛋白質分子本身的電荷差別，使各種sds-蛋白質複合物都帶有均等密度的負電荷，分子之間的電荷差異消失。
3．變性效應：sds同時還破壞了蛋白質中的非共價鍵，導致蛋白質變性，使sds-蛋白質複合物在溶液中呈現相似的形狀。因此，蛋白質在sds-page凝膠中的電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，而主要取決於分子量的大小。
在進行sds-page電泳時，同時使用蛋白質分子量標準樣品，則可以在電泳完畢後根據標準分子量大小得知樣品蛋白質的相對分子量。
4．凝膠對樣品的濃縮效應：sds-page使用一種不連續的緩衝系統，即分為低濃度的濃縮膠和較高濃度的分離膠，配製這兩種凝膠所用緩衝液的ph值和離子強度也不相同。電泳時，樣品中的sds-蛋白質複合物首先經過濃縮膠，體積得到極大的濃縮，然後再經過分離膠被分離。
sds-page凝膠已經成為實驗室常用的蛋白質分離方法，通常被用於蛋白質製品純度的鑑定和蛋白質分子量的測定。
【試劑器材】
1．30%凝膠貯備液稱取 30g 丙烯醯胺和n，n′-亞甲雙丙烯醯胺0.8g，用去離子水配製成100ml 的溶液，過濾，貯存於棕色瓶中，4℃冰箱儲存。
2．10%凝膠貯備液稱取10g丙烯醯胺和n，n′-亞甲雙丙烯醯胺0.5g，用去離子水配製成100ml 的溶液，過濾，貯存於棕色瓶中，4℃冰箱儲存。
3．10% sds 用去離子水配製，貯存於室溫中。
分子生物學
清道夫細胞 處理氧化修飾了的膽固醇，不具備膽固醇轉化作用，最終導致膽固醇細胞破裂。2 逆轉錄 以病毒rna為模板，指導含有全部病毒資訊的dna合成過程。3 細胞凋亡 在基因程式性控制下有別於細胞壞死的一種，有規律的自我消亡。4 dna的c值 同種生物基因組dna含量是恆定的，乙個單倍體基因組中的dn...
分子生物學
第一章緒論 一 dna的發現 1928年英國科學家griffith等人發現肺炎鏈球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。首先用實驗證明基因就是dna分子的是美國著名的微生物學家 ery。1952年，美國冷泉港卡耐基遺傳學實驗室科學家hershey和他的學生chase從事噬菌體侵染細菌的實驗。二 分子生物學簡...
分子生物學
一 名詞解釋 1 基因 能夠表達和產生蛋白質和rna的dna序列，是決定遺傳性狀的功能單位。2 基因組 細胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質的總和。3 端粒 以線性染色體形式存在的真核基因組dna末端都有一種特殊的結構叫端粒。該結構是一段dna序列和蛋白質形成的一種複合體，僅在真核細胞染色體末端存...