（研究生、生物技術專業本科生必修課程）
課程簡介:分子生物學實驗技術已成為高水平醫學科學研究中最常用的方法,本課程簡要介紹有關基礎知識，著重系統地進行有關操作技能的訓練。
教學方式：通過實際操作，掌握有關知識和技能。
選課建議：本課程分四部分：dna分析技術、rna分析技術、pcr技術、蛋白質分析技術。
請根據自己的研究方向所需技術手段選擇其中三項內容。每部分人數限定72人（pcr技術不限人數）。
考核辦法：實驗報告+考試成績
開設部門：生物科學系
總學時： 80
教學內容：
序號主要內容主講人實驗員
一、dna製備及分析技術
實驗一、質粒的提取和純化徐建餘朱壯春
實驗二、質粒的酶切、鑑定及片段的**周天戟王艷茹等
二、rna製備及分析技術
實驗三、rna的提取
實驗四、rna變性瓊脂糖凝膠電泳
實驗五、探針的標記
實驗六、northern雜交
三、pcr技術
實驗七、聚合酶鏈反應
四、蛋白質分析技術
實驗八、sds-page及分子量的測定
實驗九、western-blot
實驗十、凝膠圖譜分析
「分子生物學實驗技術」選課登記表
「分子生物學實驗技術」選課登記表
實驗一質粒dna的提取和純化
一、 質粒dna的提取
質粒：pbs[gapdh]為4.0kb，其pbs載體2.8kb，gapdh cdn**段1.2kb。
宿主菌：e. coli hb101
試劑：ste: 0.1mol/l nacl
10mmol/l tris·cl (ph8.0)
1mmol/l edta
sol: (該液可配製100ml，67600 pa即10磅滅菌15分鐘，4c儲存)
50mmol/l glucose
25mmol/l tris·cl (ph8.0)
10mmol/l edta
sol: (含0.2n naoh、 1% sds，新鮮配製)
10％sds 4ml
1n naoh 8ml
水 28ml
sol: (含3mol/l kac、2mol/l ch3cooh, ph4.8)
5mol/l kac 60ml
冰醋酸 11.5ml
水28.5ml
鹼裂解法小提質粒
1. 提取瓊脂板上的單菌落，移至含有3ml lb培養液（含適當的抗生素）的培養三角瓶（20ml），37c，強烈搖振過夜。（挑出3~5個菌落分別培養）
2. 取出培養液1ml移至ep管中，4c，12000g，30秒。
3. 棄上清，用1ml ste懸浮菌體沉澱，再離心**菌體；再重複用1ml ste懸浮菌體沉澱，離心後，棄上清。
4. 將細菌沉澱懸浮於100l冷sol中，強烈混勻。
5. 加200l sol，顛倒離心管5次混勻懸液，冰浴3分鐘（根據不同菌株可適當縮短時間：暴露在強鹼性溶液中過長，共價閉合環狀質粒dna可發生不可逆的變性，導致內切酶切割困難，質粒dna遷移率降低一倍左右，eb染色效率底）。
6. 加150l sol，顛倒混勻10秒，冰浴3-5分鐘。
7. 12000g，4c離心5分鐘，取上清移至新ep管。
8. 加等體積酚/氯仿(1:1)，振盪混勻；12000g，4c離心2分鐘。
9. 取上清至新管，加2倍體積95%乙醇（rt），振盪混勻，室溫放置2分鐘（不要-20c沉澱，否則有較多鹽析出）。
10. 12000g，4c離心5分鐘，棄上清。
11. 加1ml 70%冷乙醇，振盪漂洗沉澱。4c 12000g 2分鐘。
12. 棄上清，吸淨管壁上的乙醇水珠，室溫蒸發痕量乙醇。
13. 加入50l ter（ph8.0）（te中含無dna酶的rna酶20g/ml）溶解dna，短暫振盪5分鐘後可進行內切酶酶切實驗，或-20c儲存。
二、質粒dna的純化
聚乙二醇沉澱法
本方法經濟簡單，純化的質粒可適用於細菌轉化、酶切，尤其對減裂解法提取的質粒純化效果更好。
1. 3ml質粒液移至一離心管加入3ml冷5mol/l licl，混勻，4c,12000g,10分鐘。
2. 將上清分裝2管，加等量的異丙醇，混勻靜置2分鐘。室溫12000g，10分鐘。
3. 棄上清，流盡殘夜，加70％乙醇漂洗沉澱及管壁。4c,12000g,5分鐘。棄上清，室溫蒸發殘存乙醇。
4. 加500l ter(含無dnase的胰rnase 20g/ml的te,ph8.0)溶解沉澱，將溶液移至新ep管，室溫放置30分鐘。
5. 加500l 13%(w/v)聚乙二醇(peg8000)的1.6mol/l nacl，充分混勻，用12000g離心5分鐘，以**質粒。
6. 棄上清，用400l te(ph8.0)溶解沉澱質粒dna。
7. 用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次。
8. 上清移至ep管，加100l的10mol/l乙酸銨，混勻，加2倍體積（約1ml）乙醇，混勻，室溫10分鐘。4c, 12000g , 10分鐘。
9. 棄上清（暫時儲存上清，以防止不完全沉澱），200l冷70%乙醇漂洗質粒dna。4c,12000g,2分鐘。
10. 棄上清，蒸發殘存乙醇。
11. 加500l te(ph8.0)溶解dna(此步可適當減少te量，以防濃度過稀)，-20c儲存。
12. 測od260、od280值，進行dna定量及純度判斷。
5l樣品＋1ml水；od260×10(g/l)；1.6實驗二質粒的酶切鑑定及片段**
一、小量酶解反應
主要應用於質粒的酶切鑑定。10ul反應體積中含1g dna，酶切反應體系如下：
質粒dna 1l
10×緩衝液 1l
兩種限制酶各 0.5l +0.5l
雙蒸去離子水 7l
總體積 10l
[操作方法]
按下列順序加入試劑：
(1)在一滅菌的新的ep管中加入7ul雙蒸水。
(2)加入10×緩衝液1l 。
(3)加限制酶kpn i 0.5l，sac i 0.5l。
(4)最後加入質粒dna ll。
(5)稍離心，混合。
(6)37℃水浴1—1.5h。
(7)取出後電泳分析鑑定是否酶解。
[注意事項]
(1)雙蒸水為可變體積，當其它反應成分確定後，用雙蒸水將反應體積補足。
(2)質粒dna最後加入，以防止操作不當引起試劑的汙染。
(3) 大多數限制酶均加50％甘油緩衝液置於-20℃儲存，其活力，穩定，但在配製反應混合物時，酶的加入量要準確限制小於總體積的l／10，否則甘油會抑制酶解反應。
二、凍溶法從瓊脂糖凝膠中**dna
在重組dna或探針標記等實驗中，常常需要從凝膠中**和純化dna，常用的**方法有：壓碎浸泡法、透析袋洗脫法、低熔點瓊脂糖法和deae—纖維素膜法等。
[操作方法]
(1) 從瓊脂糖凝膠中將含有擬**dn**段的膠塊切下，置於ep管內。
(2) 用一次性注射器將膠由針頭處擠入ep管內，加等體積tris平衡酚混勻後，置液氮10min。
(3) 取出離心，5000g，5min。
(4) 小心地將水相轉移至另一ep管中。
(5) 加等體積酚：氯仿（1：1）充分混勻。離心，5000g，5min。
(6) 將水相轉移ep管中，加等體積氯仿：異戊醇（49：1）充分混勻。
(7) 離心，5000g，5min。
(8) 在轉移出的水相中加1／10體積3mol乙酸鈉(ph5.2)和2.5倍體積的預冷的無水乙醇置-30℃30min。
(9) 離心，12000g，15min．
(10)棄上清，加預冷的70％乙醇1ml，12000g，離心5min。棄上清，室溫放置數分鐘。
(11)將沉澱用20ul te緩衝液(ph8.0)溶解，-20℃儲存備用。
實驗三真核細胞總rna的製備
從細胞中分離rna的純度於完整性對於許多分子生物學實驗至關重要。如northern印跡與雜交分析、寡聚（dt）纖維素選擇分離mrna，cdna合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上決定於rna的質量。
rna分離的最關鍵因素是儘量減少rna酶的汙染。
快速一步法提取總rna
組織及有核細胞在勻漿過程中被變性液破膜、溶解，變性劑抑制rna酶的活性，並使蛋白質變性及與核酸分離。經酸酚/氯仿將rna抽提至水相，與dna和蛋白質分離，再經異丙醇沉澱**總rna。
【試劑】
1×csb緩衝液： 檸檬酸三鈉25mmol/l ph7.0
十二烷基肌苷酸鈉 0.5%
巰基乙醇0.1mol/l
配製100ml 5×cs緩衝液：檸檬酸三鈉3.6762，十二烷基肌苷酸鈉2.
5g溶於100ml 0.05％depc水中，過濾，15lb/in2， 20min，去depc，4c儲存。
用前100ml工作液加巰基乙醇700l。
4mol/l異硫氰酸胍變性緩衝液：
47.26g異硫氰酸胍加至100ml csb緩衝液中。
配製：23.63g異硫氰酸胍加熱65c溶於20ml無rnase水中，加10 ml 5×cs，加350l 巰基乙醇，用無rnase的水定量至50ml。（約加25ml水）
2mol/l 乙酸鈉naac（ph4.0）：
16.4g乙酸鈉加至0.05％depc水40ml，用冰乙酸調ph至4.0，定容至100ml，分裝，高壓20min去除depc。
3mol/l 乙酸鈉naac (ph5.2):
24.6g乙酸鈉加至0.05％depc水80ml，用冰乙酸調ph至5.2，定容至100ml，分裝，高壓20分鐘去除depc。
分子生物學
清道夫細胞 處理氧化修飾了的膽固醇，不具備膽固醇轉化作用，最終導致膽固醇細胞破裂。2 逆轉錄 以病毒rna為模板，指導含有全部病毒資訊的dna合成過程。3 細胞凋亡 在基因程式性控制下有別於細胞壞死的一種，有規律的自我消亡。4 dna的c值 同種生物基因組dna含量是恆定的，乙個單倍體基因組中的dn...
分子生物學
第一章緒論 一 dna的發現 1928年英國科學家griffith等人發現肺炎鏈球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。首先用實驗證明基因就是dna分子的是美國著名的微生物學家 ery。1952年，美國冷泉港卡耐基遺傳學實驗室科學家hershey和他的學生chase從事噬菌體侵染細菌的實驗。二 分子生物學簡...
分子生物學
一 名詞解釋 1 基因 能夠表達和產生蛋白質和rna的dna序列，是決定遺傳性狀的功能單位。2 基因組 細胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質的總和。3 端粒 以線性染色體形式存在的真核基因組dna末端都有一種特殊的結構叫端粒。該結構是一段dna序列和蛋白質形成的一種複合體，僅在真核細胞染色體末端存...