實驗四質粒的提取和轉化
實驗五 dna瓊脂糖凝膠電泳
1、實驗原理：
（1）質粒提取和轉化:質粒是獨立於細菌等微生物細胞染色體外，能夠自主複製和穩定遺傳的dna分子，通常為雙鏈共價閉合環狀分子，以超螺旋形式存在，是最常用的基因轉殖載體。除質粒外，宿主細胞中還含有基因組dna，各種dna，蛋白質和脂類等物質，因此需要裂解細胞並除去蛋白質和染色體dna等物質才能夠分離純化出質粒dna，鹼裂解法利用質粒dna與染色體dna之間變性與復性的差異而達到分離的目的，在ph高達12.
6的鹼性條件下染色體dna的氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性，質粒dna的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈互相纏繞，不會完全分離。以ph4.8的乙酸鉀高鹽緩衝溶液調節ph至中性時，質粒dna復性而染色體dna不復性。
除去後，進一步用酚、氯仿使蛋白質變性除雜，最後用無水乙醇沉澱，即可獲得純化的質粒dna。
（2）電泳：利用dna分子在瓊脂糖凝膠中泳動時的電荷效應和分子篩效應而達到分離、鑑定dna的目的。dna分子在高於其等電點的ph溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動，不同的dna分子因所帶電荷，分子量大小和構型不同，在同一電泳系統中的泳動速度不同，因而可以彼此分離，並檢測其分子大小。
分子量越大跑的越慢。螢光染料（如溴化乙啶eb）可嵌入雙鏈dna分子鹼基之間，在紫外線下發出螢光。
2、實驗結果
(1)上圖中左側的為puc18的電泳結果，其中下數第4條電泳帶是我們組的實驗結果，電泳結果顯示有兩條帶，跑的最遠的條帶是超螺旋構型，即我們需要的質粒載體puc18。
(2)上圖中右側的為pcdna3.1-sp1的電泳結果，其中下數第6條是我們組的實驗結果，電泳結果顯示最亮的一條帶，就是我們需要的超螺旋目的基因。
3、 誤差分析
(1)提取puc18質粒時溫和顛倒次數過多，開啟蓋子時沒有注意觀察是否有拉絲現象。
(2)在向puc18樣品中加入2倍體積無水乙醇的過程中，開始時加入無水乙醇體積過少，加入一段時間後才注意到，並再次加入無水乙醇，導致實驗時間的延長，並且對實驗結果有一定的影響。
(3)加樣過程中，將樣品與上樣緩衝液混合的過程中不小心出現了氣泡，使移液槍的槍頭裡的溶液分為數層，為後期向凝膠中滴樣造成一定的困擾，槍內氣體會上浮影響視野。
(4)另外在加樣過程中要注意槍頭要伸入電泳緩衝液液面以下，凝膠以上，防止槍頭戳破凝膠，混合液滲漏。
(5)在加入氯仿並離心取上清液的時候，一定要注意不要因為想盡量多的取上清液而誤將氯仿也取入。可以通過觀察新管中有無液體分層現象檢驗，如果誤將氯仿取入，則再離心兩分鐘取上清液即可。
(6)用移液槍取氯仿時，一定要注意雖然是取相同液體，但是前後放入不同離心管也要更換槍頭，防止汙染。氯仿取完要及時蓋上細口瓶的瓶塞，因為氯仿有毒。移液槍槍頭內有液體時不能倒置或平放，否則溶液會倒流腐蝕槍體，影響取液體積的精確度。
分子生物學實驗報告 2019版
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