1. 質粒提取
1.1 小提質粒
1.2 小量快提質粒鑑定：
1.3 大提質粒：
2. 酶切
2.1 製備型酶切
2.2 小量酶切鑑定
2.3 dn**段5'突出端的補平
3. 瓊脂糖凝膠電泳
4. **
4.1 從低熔點瓊脂糖凝膠中**dn**段
4.2 小量膠**dn**段試劑盒操作（見操作手冊）
4.3 無水乙醇沉澱**
5. 連線
5.1 一般連線
5.2 平端動態連線
6. 轉化
6.1 質粒快速轉化
6.2 連線物轉化
7. 制普通固體培養板
8. 塗板
9. 挑菌
10. 血清中病毒核酸的提取(蛋白酶k法)
哺乳動物細胞單轉殖株分離
常用溶液、培養基配製
1. 質粒提取：
1.1 小提質粒：
本實驗室在常規條件下採用鹼裂解法小量提取質粒
做完實驗請及時收拾實驗台 *
1.2 小量快提質粒鑑定：（目前較少採用）
(1)取培養的菌液1ml，12000rpm 離心30s，收集菌體，在紙上扣幹殘留培養液。
(4)12000rpm 離心10分鐘。
(5)小心吸取5ul上清上樣電泳。(對於插入片段足夠大的重組子，其遷移率應低於未插入片段的對照質粒。)
* 做完實驗請及時收拾實驗台 *
1.3 大提質粒：
(1)從－20℃儲存的甘油菌吸取50ul菌液，接種到3～4ml的lb培養基中，37℃振盪培養至od600為1.6～1.8。
(2)取0.5ml菌液接種到200ml lb培養基中，37℃振盪培養至od600為2.0以上，再加入氯黴素至170ug/ml，37℃繼續振盪培養12～16hr。
(3)將搖好的菌液4000rpm離心15min。
(4)棄上清，敞開離心管口倒置，盡量讓上清全部流盡。
(5)用預冷的40ml ste充分懸浮菌體沉澱。
(6)4℃，4000rpm離心10min。
(7)棄上清，敞開離心管口倒置，讓上清全部流盡。
(8)用預冷的4ml溶液ⅰ充分懸浮菌體沉澱。
(9)加入新鮮配製的溶液ⅱ 8ml，上下顛倒幾次，液體會變得澄清，置於4℃10min。
(10)加入預冷的溶液ⅲ 6ml，上下顛倒混勻後，4℃中放置30min。
(11)4℃，12000rpm離心10min。
(12)收集上清，加等體積的異丙醇，4℃放置30min。
(13)4℃，10000rpm離心10min。
(14)棄上清，用70％的乙醇洗沉澱一次，室溫吹乾，溶於1ml 1×te中。
(15)加50ul rnasea，37℃作用2小時。
(16)加1ml新配製的13％的peg8000溶液（13%peg8000，1.6m nacl），充分混勻，4℃放置30min。
(17)4℃，12000rpm離心15min。
(18)吸去上清，用400ul 1×te溶解沉澱。
(19)加1/4體積4m licl，室溫放置5min，12000rpm離心5min。
(20)取上清，用酚、酚－氯仿-異戊醇各抽提一次。
(21)將水相轉入一新的eppendorf管中，加入1/10體積4m licl，2倍體積的無水乙醇，－20℃放置30min。
(22)4℃，12000rpm離心10min，去上清，70％的乙醇洗沉澱一次，室溫晾乾。
(23)加200ul 1×te溶解沉澱，測定質粒dna的濃度後於－20℃儲存備用。
做完實驗請及時收拾實驗台 *
2. 酶切：
2.1 製備型酶切：
(1)在滅菌過的新0.5ml eppendorf管中加入下列成分混合：
注意：酶切時酶要在最後才加，加酶時要用新的槍頭，動作要迅速，酶不要在空氣中暴露過久；要盡量保持低溫，不要用手直接接觸儲存管上裝酶的部位；用完後要蓋緊放回原處；要用新酶或有問題時請找管理員xxy。
注意：酶切時用酶量不能過大，過大會影響酶切並且可能會有星號效應。引起酶切效果不佳的原因一般多是質粒沒有提好。除個別特殊位點或內切酶外，酶切時間均不宜過長。
* 為了保證酶切效率(至少在75%以上)，需選用合適的反應緩衝液，不同公司的酶切反應緩衝液基本上可以通用。但需注意有的要另外加bsa(10×和100×的都有)。
(2)37℃反應3～4小時(可依據所使用酶的需要，選用合適的酶切時間和溫度)。
(3)取1～2ul電泳鑑定。
做完實驗請及時收拾實驗台 *
2.2 小量酶切鑑定
(1)在滅菌過的新0.5ml eppendorf管中加入下列成分混合：
注意：酶切時酶要在最後才加，加酶時要用新的槍頭，動作要迅速，酶不要在空氣中暴露過久；要盡量保持低溫，不要用手直接接觸儲存管上裝酶的部位；用完後要蓋緊放回原處；要用新酶或有問題時請找管理員xxy。
注意：酶切時用酶量不能過大，過大會影響酶切並且可能會有星號效應。引起酶切效果不佳的原因一般多是質粒沒有提好。除個別特殊位點或內切酶外，酶切時間均不宜過長。
注意：做小量酶切鑑定時要盡量選用較為廉價的酶
* 請根據保證酶切效率(至少在75%以上)的需要選用合適的反應緩衝液，不同公司的酶切反應緩衝液基本上可以通用。但需注意有的要另外加bsa(10×和100×的都有)。
(2)37℃反應2～3小時(可依據所使用酶的需要，選用合適的酶切時間和溫度)。
(3)取1～2ul電泳鑑定。
做完實驗請及時收拾實驗台 *
2.3 dn**段5'突出端的補平:
(1)在滅菌過的新0.5ml eppendorf管中加入下列成分混合：
注意：酶要在最後才加，加酶時要用新的槍頭，動作要迅速，酶不要在空氣中暴露過久；要盡量保持低溫，不要用手直接接觸儲存管上裝酶的部位；用完後要蓋緊放回原處；要用新酶或有問題時請找管理員xxy。
(2)37℃反應1小時後，低熔點瓊脂糖凝膠**。
做完實驗請及時收拾實驗台 *
3. 瓊脂糖凝膠電泳：
(1) 製備凝膠：根據需要，在指定的三角瓶中配製50/100ml特定濃度的瓊脂糖凝膠。首先在電子天平上稱取一定量的瓊脂糖粉，倒入指定的三角瓶中，加入100ml1×tae,再加入3～4ul溴化乙錠(eb),混勻，在微波爐中煮化(大約4～5min)，混勻後倒入插好樣品梳的凝膠槽中,凝固後備用。
溴化乙錠(eb)有潛在的致癌性，操作時要戴手套，並且注意不要汙染其它操作區 *
分子生物學實驗技術
研究生 生物技術專業本科生必修課程 課程簡介 分子生物學實驗技術已成為高水平醫學科學研究中最常用的方法,本課程簡要介紹有關基礎知識，著重系統地進行有關操作技能的訓練。教學方式 通過實際操作，掌握有關知識和技能。選課建議 本課程分四部分 dna分析技術 rna分析技術 pcr技術 蛋白質分析技術。請根...
分子生物學
清道夫細胞 處理氧化修飾了的膽固醇，不具備膽固醇轉化作用，最終導致膽固醇細胞破裂。2 逆轉錄 以病毒rna為模板，指導含有全部病毒資訊的dna合成過程。3 細胞凋亡 在基因程式性控制下有別於細胞壞死的一種，有規律的自我消亡。4 dna的c值 同種生物基因組dna含量是恆定的，乙個單倍體基因組中的dn...
分子生物學
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