要點：回顧微生物學的主要研究物件和基本方法；對微生物在自然界物質迴圈中所起的作用、微生物的代謝特徵和生態習性有進一步的了解。
環境生物工程的本質就是將生物技術應用於解決環境保護領域中面臨的問題，改善優化人類生存環境，促進人類社會與自然環境的和諧可持續發展。與以往的利用物理化學手段解決人類生境惡化的方式不同，生物學方法更重視環境的自然規律，手段更為溫和，對環境的再破壞更小，也更為經濟可行，所以環境生物工程也受到越來越多的國家**和企業的重視，人們也越來越自發的樹立起良好的環境保護意識。
在環境生物工程中所涉及到的生物學內容主要是微生物學範疇(也含有部分動植物學內容)，所應用到的生物技術主要包括基因工程、微生物工程、酶工程、細胞工程等。與環境生物工程密切相關的生物主要是微生物，包括原核的細菌、放線菌、藍細菌；真核的原生生物(單細胞類，如鞭毛蟲，肉足綱的變形蟲、太陽蟲、表殼蟲，纖毛蟲綱的草履蟲、鐘蟲，孢子蟲綱的瘧原蟲；顯微藻)、微型後生動物(多細胞類，如輪蟲、水蚤、線蟲)、真菌、部分高等植物(水生陸生)；以及病毒。這些生物涉及到水 (給排水、迴圈冷卻水、天然水體) 處理、空氣汙染生物治理、汙染場地的生物修復、生物可降解材料的生產、生物能源的製取、重金屬的吸附和有毒有害化合物的生物降解等。
一、 微生物的定義、化學組成和分類
1. 微生物定義：一切肉眼看不清或看不見的微小生物的總稱。
2. 微生物細胞的化學組成：c、h、o、n、p、s、fe、mg、ca、zn…….
3. 分類.國際通用生物分類法則，林奈創立的「雙名法」：屬名+種名加詞
如：金黃色葡萄球菌 stapylococcus aures
巴斯德酵母 saccharomyces pastori
二、 微生物在自然界物質迴圈中的作用
1. 碳素迴圈
碳素迴圈主要包括空氣中的co2通過光合作用生成有機化合物，以及有機物被分解釋放出co2到大氣中，這是自然界最基本的物質迴圈。
光能和化能自養菌把大氣中的co2固定成有機碳----活細胞組分。其中一部分有機碳通過食物鏈在生態系統中轉移。食物鏈各營養級機體的呼吸作用釋放出co2，機體的排洩物和屍體被還原者分解而釋放出co2。
在缺氧條件下，有機物分解一般不完全，積累的有機質經地質變遷形成煤、石油等礦物燃料。這部分有機碳從生態系統中損失，當火山爆發或礦物燃料被開採後，其中的碳大部分再轉變成co2。礦物燃料作為化工原料時，生產出各種各樣非生物性含碳化合物，這使得碳迴圈變得更為複雜(人工合成的有機化合物不少是抗生物降解的)。
產ch4 菌利用有機物厭氧分解中產生的h2和co2作為底物進行代謝活動，從而使有機物繼續分解；生成的ch4逸入好氧環境被甲烷氧化菌氧化為co2。在有氧條件下，幾乎所有的碳都轉變為co2。
1.1 碳的有機化(固定)
1.2 有機碳礦化(co2再生)
2. 氮素迴圈產
程中形成的n2o也是重要的溫室氣體。
2.1 固氮作用
2.2 氨化作用
2.3 硝化作用
●進行硝化作用的微生物有：
2.4 反硝化作用
●進行反硝化作用的微生物有：
3. 硫素迴圈
4. 磷素迴圈
三、微生物的生物地球化學迴圈活動對環境造成的汙染和危害
●亞硝酸、亞硝胺和硝酸
●氮氧化物和羥胺
●硫化氫
●酸性礦泉水
三、微生物培養技術
1. 微生物菌種取樣、滅菌
1.1 取樣
微生物菌種主要**於自然界或菌種保藏機構。
自然界中的微生物是混雜生長的，直接而快速獲得所需菌種可以向菌種保藏機構索取有關菌種。如中國微生物菌種保藏管理委員會(ccccm)、美國標準菌種保藏中心(atcc)、英國國家典型菌種保藏所(mctc)荷蘭真菌中心收藏所(cbs)、德國科赫研究所(rki)、日本大阪發酵研究所(ifo)、法國里昂巴斯德研究所(ipl)等。
取樣就是根據微生物的生態特點從自然界取樣分離所需菌種的過程。如從堆積有枯枝落葉或朽木的地方分離產纖維素酶的菌種，從果皮上、果樹下的土壤中分離酒精酵母，從豆科植物根部土壤中分離根瘤菌，從油田附近土壤中分離出石油酵母，從汙泥中分離得到產甲烷菌，從海洋中分離出耐鹽菌和低溫菌等。
土壤是微生物生長的大本營，尤以細菌和放線菌居多(水體和大氣中的微生物多數是從土壤中散發出去的)。如果事先不了解某生產菌的具體**，一般可先從土壤中分離；1ｇ表土中含微生物約為百萬至數十億個，且種類也因土質不同而有所差異。從土壤中取樣時應該注意以下幾個方面：
●土壤有機質和通風狀況；田園土、耕作土層有機質豐富，土壤呈團狀顆粒，通氣保水效能好，微生物生長旺盛數量多，適於細菌和放線菌生長。山坡林地植被厚，有機質豐富，陰濕，適於黴菌、酵母菌生長。沙土、無植被山地、新開墾生土微生物種類數量都偏少。
●土壤酸鹼度和植被狀況； 中性或偏鹼(ph7.0—7.5)性土壤適於細菌和放線菌生長；偏酸性(ph7.0以下)土壤適於黴菌和酵母菌生長。果園菜地土壤中酵母菌較多。
●地理條件；南方土壤中微生物種類數量較北方多(溫度濕度都適於)。
●季節與氣候；春秋季節溫度濕度適於微生物生長；土壤水分過多不利於好氧微生物生長(酵母菌，黴菌，放線菌)生長。
●取樣方法：土壤取樣在選好地點後，用無菌小鏟剔出表土，取距地表5—15㎝處的土壤幾十克，裝入消毒牛皮紙袋或塑膠袋中，作好標記(時間、地點、環境狀況等)。
根據微生物生理特點取樣：如森林土及肉類加工廠、飲食店排水溝的汙泥中會有許多蛋白酶產生菌；糧食(麵粉)加工廠、酒廠、澱粉加工廠等場所，容易分離出產澱粉酶、糖化酶的菌株；篩選高溫酶產生菌時，通常應到溫度較高的地方(南方、溫泉、火山口附近及北方的堆肥中)取樣；大多數微生物在中溫、中性ph條件下生長，能在高溫、低溫、酸性、鹼性、高鹽、高輻射強的環境下生存的微生物被稱為極端微生物。
1.2 滅菌
滅菌是指用理化方法殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體。
常用的滅菌方法可分為物理和化學兩類，即物理法---乾熱(烘燒或灼燒)、濕熱(常壓和高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量
無菌水沖洗等；化學法---公升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇爾、漂白粉、抗菌素、酒精等化學藥品處理。
2. 傳統的微生物分離、純培養技術
用微生物純培養技術對微生物進行分離純化，這種獲得單一的微生物包括純種分離和培養兩個過程。純種分離的方法主要有兩大類，即單細胞或單孢子分離；以及單菌落分離。微生物純培養技術發展至今已經得到了廣泛的重視和應用，直接影響了微生物學研究領域的進步。
純培養技術使得研究者擺脫了多種微生物共存的複雜局面，從而能夠不受到干擾地對單一菌落進行研究，確保了人類對微生物形態結構、生理和遺傳特性的認識。但是，隨著研究的不斷拓展和深入，環境中微生物實際數量同平板菌落計數之間存在巨大差異；造成這種差異的原因之一是由於實驗室難以再現微生物的自然生存條件；另一方面，大種群微生物易形成生長優勢而抑制小種群的生長。因此，傳統的純培養技術總是重複篩選到相同的微生物，而多數難以被常規實驗室方法培養的微生物被稱為未培養微生物或不可培養微生物(uncultured microorganism)。
微生物自然生存環境的複雜多變造就了微生物的自然多樣性，如結構多樣性、代謝多樣性、行為多樣性、進化多樣性、生態多樣性等。有學者根據現有的資料推測微生物種類數目應該在105-106 ，但用傳統的微生物純培養技術對不同生境微生物可培養性的驗證來看，海水中可培養微生物約佔0.001%-0.
1%，土壤約佔0.3%，活性汙泥約佔1%-15%。有研究表明99%的微生物遺傳多樣性由於純培養的困難而丟失，目前尚難以**這些未培養微生物對人類的貢獻。
因此，發現，認識和開發這一巨大的微生物資源對人類具有重大意義。對獲取未培養微生物的研究主要集中在兩個方面：從dna水平上通過分子生物學手段來研究它們在環境中的功能、分布和變化情況；其次是改進純培養的培養方法，力圖培養出盡可能多的微生物類群。
如①利用貧營養培養基取代富營養培養基，可抑制生長較快的微生物的大量繁殖，從而獲得特殊的微生物；②模擬構建自然環境，如構建細胞微囊，盡可能模仿微生物在自然環境中的生存情況；③在培養基中加入微生物相互作用的訊號分子，簡單地模擬微生物間的相互作用，滿足微生物生長繁殖的要求；④提供新型電子供體和受體。提供微生物需要的特殊底物有助於新陳代謝反應的進行及微生物的正常生長。⑤分散微生物細胞。
自然界生長著的微生物常常聚集形成絮體或顆粒，用超聲波適度處理微生物使細胞分散後再行培養，可以使更多微生物接觸到培養甚而是得到培養；⑥利用瓊脂替代物(如古蘭醣膠)作為固化劑，可以增加微生物的可培養性。
微生物的純種分離技術是微生物學中重要的基本技術之一；從混雜的微生物群體中獲得單一菌株純培養的方法稱為分離。①固體培養基上的分離：主要有平板表面劃線法、平板表面塗佈法、瓊脂培養基澆注法、組織分離法(主要用於分離高等真菌和某些植物病原菌。
取一小塊植株或器官組織用體積分數為0.1%的公升汞—hgcl2溶液進行表面消毒3—5分鐘，然後用無菌水洗滌數次，移置到培養基中適溫培養；3—5天後，病變組織內潛伏的微生物可向組織塊周圍擴散生長，經菌落特徵和細胞特徵觀察確認後，即可由菌落邊緣挑取部分菌種轉入斜面，對於能產生彈射孢子的高等真菌而言，可將消過毒的菌蓋剪成黃豆大的小塊，懸掛在裝有pda培養基的三角瓶內，從而能較快地獲得純培養)、選擇培養基分離法。②液體培養基中的分離：
主要是液體稀釋法，首先將待分離的材料接種於培養液中，經培養測定或估計單位容積中的含菌數目，然後進行稀釋，使稀釋後的一定容積液體中大約只含1個微生物個體；其次則將巳稀釋好的菌液1滴(0.05ml)接種於含液體培養基的試管中，搖勻，靜置培養24—48小時後，觀察如果管底只出現1個菌落，它可能就是由乙個細胞繁殖而來，該法適於細胞較大的微生物。
2.1 微生物的培養方法可分為實驗室固體(好氧、厭氧)培養和液體(好氧、厭氧)培養以及生產實踐固體和液體培養。
液體培養法：①在常壓常溫(20℃)達到平衡時，氧在水中的溶解度為6.2ml/l(0.
28 mmol/l)；這些氧只能保證氧化8.3㎎(0.046 mmol/l)葡萄糖，僅相當於培養基中常用葡萄糖濃度的1‰。
因此對好氧菌而言，生長的限制因子幾乎總是氧的**；在進行液體培養時一般可通過增加液體與氧的接觸面或提高氧分壓來提高溶氧速率。如淺層液體培養、搖床三角瓶振盪培養、液體深層培養器底部通入加壓無菌空氣培養、液體機械攪拌培養。②液體深層厭氧培養時，一般採用加有機還原劑(巰基乙酸、半胱氨酸、維生素c或庖肉等)或無機還原劑(鐵絲等)，在其上封以凡士林—石蠟層以保證氧化還原電位(eh)達到-150～-420mv。
1. 稱取新鮮除脂肪和筋膜的碎牛肉500g，加蒸餾水1000ml和1mol/l氫氧化鈉溶液25ml，攪拌煮沸15min，充分冷卻，除去表層脂肪，澄清，過濾，加水補足至1000ml。加入除碎肉渣外的各種成分，校正ph。
(ph7.8)
2. 碎肉渣經水洗後晾至半乾，分裝15mm×150mm試管約2～3cm高，每管加入還原鐵粉0.1～0.
2g或鐵屑少許。將上述液體培養基分裝至每管內超過肉渣表面約1cm。上面覆蓋溶化的凡士林或液體石蠟0.
3～0.4cm。121℃高壓滅菌15min。
環境工程微生物學
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