實驗4 氨基酸、蛋白質的主要化學性質
一、目的要求
用實驗方法驗證氨基酸、蛋白質的主要化學性質，增強感性認識。
二、原理
α-氨基酸和蛋白質均含有α-氨基醯基r—ch—c—的結構，故都能與水合
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茚三酮作用生成蘭紫色物質。
脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應不釋放氨而直接生成黃色化合物。
蛋白質分子中含有肽鍵，與雙縮脲結構相似，故在鹼性環境中能與硫酸銅結合成紫紅色的絡合物，此反應稱為雙縮脲反應。
蛋白質分子中若存在含有苯環的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸等，當其與濃硝酸共熱時，則變成黃色，這就是黃蛋白反應，若再繼續加鹼則顏色轉變成橘黃色。
若蛋白質分子中具有含硫氨基酸如半胱氨酸、蛋氨酸等，則與鹼及醋酸鉛共熱時，分解而產生硫離子，後者遇鉛鹽即生成黑色硫化鉛沉澱。
蛋白質膠體是親水膠體，若除去其質點上的水膜和電荷，蛋白質粒子則凝聚析出，這就是蛋白質的沉澱作用，使蛋白質膠體沉澱的方法有多種，常用的有下列幾種：
1、鹽析法：
加中性鹽或硫酸銨等電解質試劑於蛋白質溶液中，這些電解質離子的水化能力比蛋白質強，可以奪去蛋白質粒子外圍的水膜，並且蛋白質粒子外圍的雙電層又受到了壓縮，也就是使其所帶的電荷削弱，蛋白質膠體粒子由於失去兩種使自己穩定的因素而沉澱。
2、有機溶劑的沉澱作用：
水溶性的有機溶劑如乙醇、丙酮等，它們與水的親和力大於蛋白質，因此能破壞蛋白質粒子的水膜，而使其沉澱析出。
3、生物鹼試劑的沉澱反應：
生物鹼沉澱劑如三氯醋酸、若味酸、鞣酸等都能與蛋白質陽離子結成不溶性的鹽而沉澱析出。
4、重金屬離子的沉澱作用：
某些重金屬離子，如cu2+、hg2+、pb2+、ag+等，能與蛋白質陰離子結合成不溶性鹽類而沉澱析出。
三、器材與試劑
（一）器材
電爐、燒杯、試管。
（二）試劑
1%甘氨酸、5%蛋白質溶液、0.25%茚三酮水溶液、10%naoh、1%硫酸銅、濃硝酸、2%醋酸鉛、飽和硫酸銨溶液、95%乙醇、10%鞣酸溶液、飽和苦味酸。
四、實驗步驟
1、茚三酮反應
在兩支試管中，分別加入甘氨酸1ml和5%蛋白質溶液1ml，然後各加入0.25%茚三酮水溶液10滴，將試管放入沸水中加熱幾分鐘，觀察現象。
2、雙縮脲反應
向存有1ml 5%蛋白質溶液的試管中，加入10% naoh 10滴。充分搖勻，逐滴加入1% cuso4數滴，觀察試管中的顏色變化。
注意：硫酸銅不能多加，否則將產生藍色cu(oh)2，防礙此顏色反應的觀察。
3、黃蛋白反應
向一支盛有0.5ml 5%蛋白質溶液的試管中加入濃硝酸4滴，並加熱，觀察有何現象出現？然後再加入10% naoh 1ml，觀察有何變化？
4、蛋白質中硫的鑑定
取頭髮幾根或指甲少許，並加10%naoh 2ml 於試管內，煮沸2分鐘，冷卻後加入3～4滴2%pb(ac)2溶液，觀察其現象，說明頭髮或指甲中有什麼樣的結構存在。
5、鹽析作用
取5%蛋白質溶液1ml於試管中，加入飽和硫酸銨溶液2ml，有何現象產生？再向試管中加入6ml左右的蒸餾水，振盪後又有何變化？
6、有機溶劑的沉澱作用
取5%蛋白質溶液1ml於試管中，再加95%乙醇2ml，充分混合，觀察有無沉澱析出。
7、生物鹼試劑的沉澱作用
取2支試管，各加5%蛋白質溶液1ml，分別滴加10%鞣酸溶液5滴，飽和苦味酸5滴，有何現象產生？
8、重金屬離子的沉澱作用
取2支試管，各加5%蛋白質溶液1ml，分別加入2%pb(ac)2，1%cuso4各5滴，觀察現象。
五、思考題
1、蛋白質和氨基酸共同具有哪種顏色反應？為什麼？
2、哪種顏色反應可以用來檢驗蛋白質是否完全水解？
實驗5 蛋白質的兩性反應和等電點測定
一、目的要求
了解蛋白質的兩性性質，初步學會測定蛋白質等電點的方法。
二、原理
蛋白質是由氨基酸所組成的，雖然絕大多數氨基酸的氨基與羧基已結合成為肽鍵，但是，總有一定數量的自由氨基與自由羧基，以及酚基、巰基、胍基和咪唑基等酸鹼基團。因此，蛋白質和氨基酸一樣，是兩性電解質，具有兩性反應。調節溶液的酸鹼度達到一定的氫離子濃度時，蛋白質分子所帶的正電荷與負電荷相等，以兼性離子狀態
p存在。在電場中，該蛋白質既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的ph值，稱為該蛋白質的等電點（以pi表示）。
在等電點時，蛋白質溶解度最小（為什麼？）容易沉澱析出。
若配製體積相等的一系列不同ph值的緩衝溶液，在其中各加入等量的某蛋白質溶液，混勻後靜置一段時間，觀察並比較各管的混濁度，可知最混濁的那個試管中溶液ph即是該蛋白質的等電點。
三、器材與試劑
（一）器材：
1、試管
2、試管架
3、移液管1ml 2ml 5ml
（二）試劑：
1、0.5%酪蛋白溶液（以0.01 mol·l-1 naoh作溶劑）
2、0.04%溴甲酚綠指示劑，變色範圍為ph3.8～5.4，酸式為黃色，鹼式為蘭色，中間式為綠色。
3、0.02 mol·l-1鹽酸
4、0.02 mol·l-1naoh溶液。
5、0.5%酪蛋白的醋酸鈉溶液，取純酪蛋白0.25g置於50ml容量瓶中，加水約20ml及1 mol·l-1 naoh 5ml，待酪蛋白完全溶解後，加入1 mol·l-1醋酸5ml，用水稀釋到50ml，混勻，或將酪蛋白溶於0.
1 mol·l-1 naac溶液中。
6、0.01 mol·l-1 hac
7、0.10 mol·l-1 hac
8、1.00 mol·l-1 hac
四、實驗步驟
（一）蛋白質的兩性反應：
1、取一支試管，加0.5%酪蛋白溶液1ml 和0.04%溴甲酚綠指示劑5滴，混勻，溶液呈什麼顏色？為什麼？
2、用細滴管慢慢加入0.02 mol·l-1鹽酸，隨滴隨搖，至有明顯的大量沉澱產生時，這時溶液的ph值接近於酪蛋白的等電點，觀察溶液顏色的變化。
3、繼續滴加0.02 mol·l-1鹽酸，有什麼變化？為什麼？溶液顏色有什麼變化？說明什麼？
4、再滴入0.02 mol·l-1的氫氧化鈉將第3步加的鹽酸中和時，為什麼又會出現沉澱？繼續滴入0.
02 mol·l-1氫氧化鈉，又有什麼變化？溶液顏色又怎樣變化？說明了什麼？
（二）酪蛋白等電點的測定：
1、取直徑相似的乾燥試管5支，按下錶準確加入各種試劑：
加畢搖勻，即配成不同氫離子濃度的緩衝液，各管內溶液的ph如表中所示。
靜置約30分鐘，觀察各試管溶液的混濁度，以表示之。
注：該實驗要求各種試劑的濃度和加入量必須相當準確，實驗中應嚴格按照定量分析的要求和操作進行。
根據實驗觀察結果，指出酪蛋白達到其等電點時溶液的ph值，並說明其原因。
五、思考題
1、溴甲酚綠指示劑在實驗中起什麼作用？
2、在蛋白質兩性反應及酪蛋白等電點測定這兩個實驗中所用的酪蛋白溶液是不同的，它們有何區別？能否將它們對調使用？為什麼？
實驗6 茚三酮法測定賴氨酸的含量
一、目的要求
掌握用茚三酮簡易快速地測定賴氨酸的方法。
二、原理
在ph 3以下，只有賴氨酸才能與茚三酮呈專一性顯色反應，反應產物在475nm下有吸收峰，反應物顏色的深淺與賴氨酸的含量成正比。採用這種比色方法可以快速簡單地測定樣品中的賴氨酸含量，測定範圍在0.075～0.
2mg/ml賴氨酸。
三、器材與試劑
（一）器材
721分光光度計、電爐、大試管10支
移液管5ml×1，2ml×3，1ml×2
（二）試劑
1、茚三酮試劑
稱取茚三酮1.25g，加乙二醇甲醚94毫公升。
1.7g cucl2·2h2o溶於32ml 0.1mol/l檸檬酸，用hcl調至ph 1.3。
上述兩種溶液混合後加蒸餾水至250ml。
2、標準賴氨酸母液（0.2mg/ml），稱0.2g賴氨酸定容至1000ml。
四、實驗步驟
1、標準曲線的製作
取7支試管，分別按下錶加入各試劑
沸水浴20分鐘，使賴氨酸顯色，冷卻後用721分光光度計測定475nm處的光密度，以賴氨酸濃度為橫座標，od475nm為縱座標繪製標準曲線。
2、樣品測定
取兩根試管分別加賴氨酸待測定（賴氨酸含量約為0.075~0.2mg/ml）2ml，加茚三酮試劑4ml，以後步驟同上，測得od475nm，然後從標準曲線上查出賴氨酸的含量。
五、注意點
該法是乙個簡單快速的測定方法，標準曲線不通過原點，在賴氨酸濃度為0.075～0.02mg/ml範圍內有線性關係。
實驗8 蛋白質濃度測定（二）
lowry蛋白質測定法
一、目的要求
1、學習和掌握lowry蛋白質測定法的原理和操作方法。
2、進一步熟悉和掌握721分光光度計的使用方法。
二、原理
lowry法測定蛋白質濃度是目前應用最廣泛的一種方法：該方法是雙縮脲方法的發展，是結合了福林蛋白質定量法的敏銳性和雙縮脲法的優點和改良法。第一步是在鹼性條件下，蛋白質-銅複合物的形成；第二步是這個複合物中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸等還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑，生成藍色物質，在一定條件下，藍色強度與蛋白質含量成正比。
因此，利用一標準蛋白質配製成各種濃度，經lowry反應後，在660nm測定各濃度下的顏色強度，然後以a660為縱座標，以標準蛋白含量為橫座標，作出標準曲線，待測蛋白樣品在相同條件下操作，根據a值從標準曲線查得蛋白質含量。
三、器材與試劑
（一）器材
1、結晶牛血清白蛋白（生化試劑）
2、試管：1.5×15cm（×13）
3、吸管：0.5ml（×1），1ml（×3），5ml（×1）
4、721分光光度計
（二）試劑
1、標準蛋白質溶液：結晶牛血清白蛋白溶解於蒸餾水，濃度250微克/毫公升。
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