實驗八氨基酸紙層級

一、實驗目的

1、掌握層析技術的基本原理

2、掌握紙層析法操作步驟

二、實驗原理

1 .紙層析是以濾紙作為支援物的分配層析法，其原理是利用物質在兩種或兩種以上不同的混合溶劑中的分配係數不同，而達到分離的目的。在一定條件下，一種物質在某種溶劑系統中的分配係數是乙個常數即分配係數=溶質在固定相的濃度/溶質在流動相的濃度。

2.溶劑系統：由有機溶劑和水組成，水和濾紙纖維素有較強的親和力，因而其擴散作用降低形成固定相，有機溶劑和濾紙親和力弱，所以在濾紙毛細管中自由流動，形成流動相，由於混合液中各種氨基酸的分配系數值不同，其在兩相中的分配數量及移動速率（即遷移率rf值）就不同，從而達到分離的目的。

3.移動速率（rf）= 原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。

三，實驗試劑與儀器

1.試劑

(1）展開劑：正丁醇：88%甲酸：水=15：3：2

（2）茚三酮顯色液

（3）0.5％標準氨基酸溶液：苯丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、谷氨酸

(4)樣品氨基酸溶液：混合氨基酸

2.儀器

(1)毛細管(2)電熱吹風機(3)層析缸(4)層析濾紙（5）小型玻璃噴霧器

（6）鉛筆、直尺等。

四、實驗操作步驟

１、濾紙的準備：在20*20cm的濾紙上，距短邊2.5cm 處，用鉛筆畫一條線，叫原線，並在原線上每隔2cm作乙個記號，工作4個記號。

２、點樣：用毛細管分別吸取不同氨基酸樣品，樣品點於原點上。點一次後，晾乾後再點一次，一共點3次。

（注意：每次點在相同位置點樣直徑一般控制在0.3cm之內）.

而後用膠帶將濾紙與原線垂直的兩邊製成筒狀。

３、展開：培養皿中倒入展開劑(深不超過0.5cm)，將濾紙畫有原線的一端浸入盛有展層劑的層析缸中，原線必須在液面之上，以免氨基酸與展層劑直接接觸，蓋好層析缸，當溶劑前沿距離紙端2cm時，取出濾紙，並用鉛筆畫出溶劑的前沿界限，讓濾紙自然乾燥或用吹風機吹乾。

4、顯色：展開結束後，吹乾濾紙。噴茚三酮顯色液，熱風吹乾顯色。

五、實驗結果與計算：

1、用鉛筆將層析色譜輪廓和中心點描出來；

2、測量原點至層析點中心的距離和原點至溶劑前沿的距離，計算各種氨基酸rf值

在層析色譜中測出原線至溶劑前沿的距離為8.4cm

對色譜圖分析可知混合氨基酸由苯丙氨酸，脯氨酸，賴氨酸，蘇氨酸，谷氨酸，組成，但由於某些原因蘇氨酸和谷氨酸在色譜圖中分離的不是很明顯。

注意事項：

1、點樣時避免手或唾液等汙染濾紙。

2、點樣斑點不能太大（直徑小於0.3cm），防止層析後氨基酸斑點過渡擴散和重疊。

3、吹風機溫度不宜過高，否則斑點變黃。

4、展層開始時，切勿使樣品點浸入溶劑中。

思考題：

影響rf值的主要因素？

答:影響rf的主要因素有:①物質本身的化學結構;②展層所用溶劑系統;③展層劑ph值;

④展層時的溫度;⑤展層所用濾紙;⑥展層的方向(橫向,上行或下行).