微生物鑑定中常用生理生化試驗
一、實驗目的
1.證明不同微生物對各種有極大分子物質的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不
同的酶系統。
2.掌握微生物大分子物質水解實驗的原理和方法。
3.掌握通過糖發酵鑑別不同微生物的方法。
4.了解糖發酵的原理和在腸細菌鑑定中重要作用
二、實驗原理
由於各種微生物具有不同的酶系統，所以它們能利用的底物不同，或雖利用相同的底物但產生的代謝產物卻不同，因此可以利用各種生理生化反應來鑑別不同的細菌，尤其是在腸桿菌科細菌的鑑定中，生理生化試驗占有重要的地位。具體的原理如下：
1.澱粉水解試驗：在澱粉固體培養基上接種四種細菌（枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、銅綠假單胞菌），培養兩天以後，再往培養基中加碘液染色，若該細菌能分泌胞外澱粉酶，則能利用其周圍的澱粉，淡然在染色後，其菌落周圍不呈藍色，而是無色透明圈。
2.糖發酵試驗：不同的細菌分解糖的能力不同，有些細菌能利用糖發酵產酸和產氣，有些則不能。
酸在加入溴甲酚指示劑後會使溶液呈黃色，且德漢氏小管中會收集到一部分氣體。若細菌不能使醣產酸產氣，則最後溶液為指示劑的紫色，且德漢氏小管中無氣體。
實驗主要用於快速鑑別大腸桿菌和產氣腸桿菌。
（1）吲哚試驗：在蛋白腖培養基中，若細菌能產生色氨酸酶，則可將蛋白腖中的色氨酸分解為丙酮酸和吲哚，吲哚與對二甲基苯甲醛反應生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
（2）甲基紅試驗（mr）：某些細菌在糖代謝過程中分解葡萄糖生成丙酮酸，後者進而被分解產生甲酸，乙酸和乳酸等多種有機酸，是培養液ph值降至4.2以下，加入甲基紅後溶液呈紅色。
三、實驗材料
1.菌種
大腸桿菌（escherichia coli），銅綠假單胞菌（
枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis cohn），產氣腸桿菌(enterobacter aerogenes)，
普通變形桿菌（
2.培養基
固體油脂培養基，固體澱粉培養基，葡萄糖發酵培養基（5支，附德漢式小管），乳糖發酵培養基（5支，附德漢式小管），蛋白腖水培養基，葡萄糖蛋白腖水培養基。
3.溶液和試劑
革蘭氏染色用盧戈氏碘液，甲基紅指示劑，乙醚和吲哚試劑，無菌水。
4.儀器和其他用品
平板，試管，接種環，試管架，電子天平，稱量紙，玻璃棒，三角瓶，燒杯，藥匙，標籤紙，酒精燈，滴管。
四、實驗步驟
1.製備培養基
製備固體澱粉培養基，固體油脂培養基，葡萄糖發酵培養基，乳糖培養基（內裝有倒置的德漢氏小管），蛋白腖水培養基，葡萄糖蛋白腖水培養基，製備方法見附錄
2.澱粉水解試驗
1.將固體澱粉培養基熔化後冷卻至50℃左右，無菌操作製成平板。
2.用記號筆在平板底部劃成4部分。
3.將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌和銅綠假單胞菌分別在不同的部分點種，在平板的反面分別在4部分寫上菌名。
4將平板倒置在37℃溫箱中培養48h。
5觀察各種細菌的生長情況，開啟平板蓋子，滴入少量盧氏碘液於平板中，輕輕旋轉平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現無色透明圈，說明澱粉已被水解，為陽性。透明圈的大小可初步判斷該菌水解澱粉能力的強弱，即產生胞外澱粉酶活力的高低。
3油脂水解試驗
1將熔化的固體油脂培養基冷卻至50℃左右時，充分搖盪，使油脂均勻分布，無菌操作倒入平板，待凝。
2用記號筆在平板底部劃成4部分，分別在4部分標上菌名。
3用無菌操作將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌和銅綠假單胞菌分別劃接種於平板的相對應部分的中心。
4將平板倒置，37℃溫箱中培養48h。
5取出平板，觀察菌苔顏色。如出現紅色斑點，說明脂肪水解，為陽性反應。
4糖發酵試驗
1用記號筆在各試管外壁上分別標明發酵培養基的名稱和所接種的細菌菌名。
2取葡萄糖發酵培養基試管5支，2支分別接入大腸桿菌、2支接普通變形桿菌，第5支不接種，作為對照。另取乳糖發酵培養基試管5支，同樣分別接入大腸桿菌、普通變形桿菌，第5支不接種，作為對照。在接種後，輕緩搖動試管，使均勻，防止倒置的小管進入氣泡。
3將接過種和作為對照的6支試管均置37℃中培養48h。
4觀察各試管顏色變化及徳漢氏小管中有無氣泡。
5吲哚試驗
1用接種針將大腸桿菌、產氣腸桿菌各分別接2支蛋白腖水培養基中，第5支不接種，作為對照，置37℃中培養48h。
2於培養48h後的蛋白腖水培養基內加入3~4滴乙醚，搖動數次，靜置1min，待乙醚上公升後，沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養物之間產生紅色環狀物為陽性反應。
6甲基紅試驗
1用接種針將大腸桿菌、產氣腸桿菌各分別接2支葡萄糖蛋白腖水培養基中，第5支不接種，作為對照，置37℃中培養48h。
2培養48h後，將2支葡萄糖蛋白腖水培養基培養物內加入甲基紅試劑2滴，培養基變為紅色者為陽性，變為黃色者為陰性。
五、實驗結果
1.大分子物質的水解試驗
（1）澱粉水解實驗
「+」表示陽性，可以水解澱粉，「—」表示陰性，不可以水解澱粉
表1.澱粉水解實驗結果
（2）油脂水解試驗
「+」表示陽性，可以水解油脂，「—」表示陰性，不可以水解油脂
表2. 油脂水解試驗結果
2.糖發酵試驗
（1）葡萄糖發酵培養基
「+」表示產酸或產氣，「—」表示不產酸不產氣
表3.葡萄糖發酵培養基實驗結果
圖1.接種普通變形桿菌圖2.接種大腸桿菌的圖3.空培養基
的葡萄糖發酵培養基葡萄糖發酵培養基
（2）乳糖發酵培養基
圖4.接種大腸桿菌的乳糖發酵培養基圖5.接種普通變形桿菌的乳糖發酵培養基
(左)和空白的乳糖發酵培養基(右)
「+」表示產酸或產氣，「—」表示不產酸不產氣
表4.乳糖發酵培養基實驗結果
試驗（1）吲哚試驗
表5.吲哚試驗結果
（2）甲基紅試驗
表6. 甲基紅試驗結果
六、思考題
1．你怎麼樣解釋澱粉酶是胞外酶而非胞內酶？
答：菌苔周圍產生水解圈，可知澱粉在細胞外被水解，應該是細菌將澱粉酶分泌到胞外所致，因此為胞外酶。
2．不利用碘液，你怎樣證明澱粉水解的存在？
答：澱粉水解為葡萄糖才能被細胞利用，因此可以換用斐林試劑。呈陽性者則說明產生了葡萄糖，澱粉被水解；陰性者說明澱粉未被水解。
3．假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發酵試驗應該出現什麼結果？
答：由於產生的co2溶於水的量少且碳酸酸性若，因此顏色不變化，仍為紫色。德漢氏小管中有氣柱。
4．討論imvic試驗在醫學檢驗上的意義。
答：可以鑑別某些疾病是由大腸桿菌還是產氣腸桿菌引起的。
5．解釋在細菌培養中吲哚檢測的化學原理，為什麼在這個試驗中用吲哚的存在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸？
答：某些細菌可產生色氨酸酶，分解蛋白腖中的色氨酸產生吲哚和丙酮酸。對二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚，是紅色物質，便於觀察。
七、實驗小結
通過本次實驗我們證實了不同微生物對各種有極大分子物質的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統；了解了糖發酵的原理和在腸細菌鑑定中重要作用以及imvic的原理；並掌握了微生物大分子物質水解實驗的原理和方法以及通過糖發酵鑑別不同微生物的方法。
附錄1固體澱粉培養基的製備方法
121℃滅菌20min。
2固體油脂培養基的製備方法
121℃滅菌20min。
注：①不能使用變質油。
② 油和瓊脂及水先加熱。
③調好ph後，再加入中性紅。
④分裝時，需不斷攪拌，使油均勻分布於培養基中。
3糖發酵培養基的製備方法
另配20%糖溶液（葡萄糖，乳糖）各10ml。
制法:1 將上述含指示劑的蛋白腖水培養基（ph7.6）分裝於試管中,在每管中放一倒置的小玻璃管。
⑵將已分裝好的蛋白腖水和20%的各種糖溶液分別滅菌，蛋白腖水121℃滅菌20min；糖溶液112℃滅菌30分鐘。
⑶滅菌後，每管以無菌操作分別加入20%的無菌糖溶液0.5ml(按每10ml培養基中加入20%的糖液0.5ml，則成1%的濃度)。
配製後的試管必須洗乾淨，避免結果混亂。
4．蛋白腖水培養基的製備方法121℃滅菌20min。
5葡萄糖蛋白腖水培養基的製備方法
將上述各成分溶於1000ml水中，調ph7.0~7.2，過濾。分裝試管，每管10ml，112℃滅菌30分鐘。
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