多花木藍鹽脅迫的生理響應試驗方案

2021-12-25 18:31:16 字數 4999 閱讀 9536

材料和樣品:多花木蘭種子、nacl、完全培養液(硝酸鈣1克、磷酸二氫鉀0.25克、硫酸鎂0.25克、氯化鐵0.25克、氯化鉀或硝酸鉀0.25克)、蒸餾水。

溶液培養皿設定:設定5組不同培養條件,選擇飽滿、均勻、外觀良好的種子,放入溶液培養皿中,每皿30粒,分別加入相同量的完全培養液及6ml不同濃度的nacl溶液(濃度梯度:0g/l、2 g/l、4 g/l、8 g/l、12 g/l),編號1、2、3、4、5,第1組為對照組,實驗中每組設3個重複試驗。

將培養皿置於溫室中培養,每天下午3時適當補充蒸發水分,以維持鹽分濃度的穩定。培養相同時長,待多花木藍長出幼苗後,分別測定5組多花木藍幼苗的各項指標。

一、多花木藍幼苗生長特性指標測定

生長指標測定:記錄每組植株成活數量,計算成活率;用直尺和游標卡尺測量株高、莖粗、最大側根長。

根系活力的測定:ttc法

材料、裝置儀器及試劑

(一)材料:水培的多花木藍根系。

(二)儀器裝置:分光光度計;分析天平(感量0.1mg);電子頂載天平(感量0.

1g);溫箱;研缽;三角瓶50ml; 漏斗;量筒100ml;吸量管10ml;刻度試管10ml;試管架;容量瓶10ml;藥勺;石英砂適量;燒杯10ml、1000ml。

(三)試劑:1)乙酸乙酯(分析純);2)次硫酸鈉(na2s2o4),分析純,粉末;3)1%ttc溶液:準確稱取ttc1.

0g,溶於少量水中,定容到100ml,用時稀釋至各需要的濃度;4)磷酸緩衝液(1/15mol·l-1,ph7)。5)1mol·l-1硫酸:用量筒取比重1.

84的濃硫酸55ml,邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中,冷卻後稀釋至1000ml;6)0.4mol·l-1琥珀酸:稱取琥珀酸4.

72g,溶於水中,定容至100ml即成。

三、實驗步驟

(1)ttc標準曲線的製作:取0.4%ttc溶液0.

2ml放入10ml量瓶中,加少許na2s2o4粉搖勻後立即產生紅色的甲腙。再用乙酸乙酯定容至刻度,搖勻。然後分別取此液0.

25ml、0.50ml、1.00ml、1.

50ml、2.00ml置10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含甲腙25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的標準比色系列,以空白作參比,在485nm波長下測定吸光度,繪製標準曲線。

(2)稱取5組根尖樣品各0.5g,每組取三次,分別編號11、12、13,21、22、23,31、32、33,41、42、43,51、52、53,放入10ml燒杯中,加入0.4%ttc溶液和磷酸緩衝液的等量混合液10ml,把根充分浸沒在溶液內,在37℃下暗保溫1~3h,此後加入1mol·l-1硫酸2ml,以停止反應。

(與此同時做5個空白實驗,先加硫酸,再加根樣品,其他操作同上)。

(3)把根取出,吸乾水分後與乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起在研缽內磨碎,以提出甲腙。紅色提取液移入試管,並用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌

二、三次,皆移入試管,最後加乙酸乙酯使總量為10ml,用分光光度計在波長485nm下比色,以空白試驗作參比測出吸光度,查標準曲線,即可求出四氮唑還原量。

四、結果計算

四氮唑還原強度(根鮮重h-1)=四氮唑還原量(mg)/根重(g)×時間(h)

葉綠素含量測定:分光光度法

材料、儀器裝置及試劑

(一)材料:新鮮的多花木藍葉片。

(二)儀器裝置:1. 分光光度計;2.

電子頂載天平(感量0.01g);3. 研缽;4.

棕色容量瓶;5. 小漏斗;6. 定量濾紙;7.

吸水紙;8. 擦境紙;9. 滴管。

(三)試劑:96%乙醇(或80%丙酮);石英砂;碳酸鈣粉。

三、實驗步驟

1. 取新鮮多花木藍葉片,擦淨組織表面汙物,剪碎(去掉中脈),混勻。

2. 稱取5組剪碎的新鮮樣品各0.2g,分別放入研缽中,加少量石英砂和碳酸鈣粉及2~3ml95%乙醇,研成均漿,再加乙醇10ml,繼續研磨至組織變白。靜置3~5min。

3. 取濾紙1張,置漏斗中,用乙醇濕潤,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,過濾到25ml棕色容量瓶中,用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次,最後連同殘渣一起倒入漏斗中。

4. 用滴管吸取乙醇,將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最後用乙醇定容至25ml,搖勻。

5. 把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內。以95%乙醇為空白,在波長665nm、649nm下測定吸光度。

四、實驗結果計算:將測定得到的吸光值代入下面的式子:

ca=13.95a665-6.88a649

cb=24.96a649-7.32a665

據此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度(ca、cb:mg/l),二者之和為總葉綠素的濃度。最後根據下式可進一步求出植物組織中葉綠素的含量:

葉綠素的含量(mg/g)= [葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數]/樣品鮮重(或乾重)。

二、多花木藍幼苗生理指標測定

超氧化物歧化酶sod測定:氮藍四唑(nbt)比色法

材料、儀器裝置及試劑

(一)材料:多花木藍幼苗的葉片

(二)儀器裝置:1.高速台式離心機;2.分光光度計;3.微量進樣器;4.螢光燈(反應試管處照度為4000lx);5.試管或指形管數支。

(三)試劑 1. 0.05mol/l 磷酸緩衝液(ph7.

8);2. 130mmol/l 甲硫氨酸(met)溶液:稱1.

9399gmet用磷酸緩衝液定容至100ml;3.750μmol/l 氮藍四唑溶液:稱取0.

06133gnbt用磷酸緩衝液定容至100ml,避光儲存;4. 100μmol/l edta-na2溶液:稱取0.

03721gedta-na2用磷酸緩衝液定容至1000ml;5. 20μmol/l 核黃素溶液:稱取0.

0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml避光儲存。

實驗步驟

1. 酶液提取取一定部位的多花木藍葉片(視需要定,去葉脈)0.5g於預冷的研缽中,1ml預冷的磷酸緩衝液在冰浴上研磨成漿,加緩衝液使終體積為5ml。

取1.5~2ml於1000rpm下離心20min,上清液即為sod粗提液。

2. 顯色反應取5ml指形管(要求透明度好)4支,2支為測定管,另2支為對照管,按下錶加入各溶液

混勻後將1支對照管置暗處,其它各管於4000lx日光下反應20min(要求各管受光情況一致,溫度高時間縮短,低時延長)。

3. sod活性測定與計算至反應結束後,以不照光的對照管做空白,分別測定其它各管的吸光度。

結果計算

已知sod活性單位以抑制nbt光化還原的50%為乙個酶活性單位表示,按下式計算sod活性。sod總活性=(ack-ae)×v/(ack×0.5×w×vt)

式中:ack為照光對照管的吸光度,ae為樣品管的吸光度,v為樣品液總體積(ml)vt為測定時樣品用量(ml),w為樣品鮮重(g),蛋白質含量單位為:mg蛋白/g鮮重。

丙二醛(mda)含量測定:硫代巴比妥酸法

材料、儀器裝置及試劑

1.實驗材料:多花木藍幼苗的葉片

2.儀器:分光光度計,研缽,剪刀,恆溫水浴,試管20 ml×4, 離心機。

3.試劑:5 %三氯醋酸;0.5 %硫代巴比妥酸(用5 %三氯醋酸溶解定容);

0.05 mol · l–1磷酸緩衝液ph 7.8。

實驗步驟

1.取小麥植株上不同葉位的葉片3~5片,洗淨擦乾,剪成0.5 cm長的小段,混勻。

2.稱取葉片切段0.3 g,放入冰浴的研缽中,加入少許石英砂和2 ml 0.05 mol · l-1磷酸緩衝液,研磨成勻漿。

將勻漿轉移到試管中,再用3 ml 0.05 mol · l-1磷酸緩衝液,分三次沖洗研缽,合併提取液。

3.在提取液中加入5 ml 0.5 %硫代巴比妥酸溶液,搖勻。

4.將試管放入沸水浴中煮沸10 min,(自試管內溶液**現小氣泡開始計時)。到時間後,立即將試管取出並放入冷水浴中。

5.待試管內溶液冷卻後,3000×g離心15 min,取上清液並量其體積。以0.5 %硫代巴比妥酸溶液為空白測532 nm、600 nm和450 nm處的消光值。。

3.計算含量

式中,vt:提取液總體積(ml);vs:測定用提取液體積(ml);fw:樣品鮮重(g)。

葉綠素含量測定:丙酮比色法

葉片細胞電導率:將葉片樣本在蒸餾水中浸泡8-10小時,再用電導率儀測定。

材料、儀器裝置及試劑

(一)材料:小麥、女貞葉片;

(二)儀器裝置:1)電導儀;2)天平;3)溫箱;4)真空乾燥器;5)抽氣機;6)恆溫水浴鍋;7)注射器。

(三)試劑:nacl溶液

實驗步驟

1)製作標準曲線:如需定量測定透性變化,可用純nacl配成0、10、20、40、60、80、100μg/ml的標準液,在20~25℃恆溫下用電導儀測定,可讀出電導度。

2)選取小麥或其他植物在一定部位上生長葉齡相似的葉子若干,剪下後,先用紗布拭淨,稱取二份,各重2g。

3)乙份插入小杯中放在40℃恆溫箱內萎蔫0.5~1h,另乙份插入水杯中放在室溫下做對照。處理後分別用蒸餾水沖洗二次,並用潔淨濾紙吸乾。

然後剪成長約1cm小段放入小玻杯中(大小以夠容電極為度),並用玻棒或乾淨尼龍網壓住,在杯中準確加入蒸餾水20ml,浸沒葉片。

4)放入真空乾燥器,用抽氣機抽氣7~8min以抽出細胞間隙中的空氣;重新緩緩放入空氣,水即被壓入組織中而使葉下沉。

5)將抽過氣的小玻杯取出,放在實驗桌上靜置20min,然後用玻棒輕輕攪動葉片,在20~25℃恆溫下,用電導儀測定溶液電導率。

6)測過電導率的之後,再,放入100℃沸水浴中15min,以殺死植物組織,取出放入自來水冷卻10min,在20~25℃恆溫下測其煮沸電導率。

比較不同處理(萎蔫處理與對照)的葉片細胞透性的變化情況,記錄結果,並加解釋。

傷害率=處理電導率/煮沸電導率

可溶性糖含量:80%乙醇提取後用蒽酮比色法測定

器材與試劑

1. 實驗儀器分光光度計,恆溫水浴,電子天平,烘箱,刻度試管,漏斗

2. 實驗試劑活性炭,乙醇

葡萄糖標準液:稱取已在80℃烘箱中烘至恒重的葡萄糖100 mg,用80%乙醇配製成1000 ml溶液,即得每ml含糖為100 μg的標準液

蒽酮試劑:稱取1 g 蒽酮,溶解於1000 ml稀硫酸(將760 ml相對密度為1.84的濃硫酸用蒸餾水稀釋成1000 ml)溶液中,置於棕色瓶中,當日配置使用。