1 放射物標記分析
用放射物標記抗原或抗體發展的放射免疫分析(radio immunoassay, ria)是美國科學家yalow和berson於2023年創立的一種微量分析法,它是將具有高靈敏度的放射性核素示蹤技術和特異性免疫化學技術相結合而建立的新方法[3]。該技術利用核素標記物的放大效應,改善了待測物的檢測下限,同時以抗體或抗原作為結合試劑,大大提高了檢測方法的特異性。
1.1 標記物種類
一般來說,ria中標記抗原或抗體所用的放射性核素,最常用的是125、121、3h,3h能放射出b射線,而125、121能放射出c射線,然後用c計數儀和液體閃爍計數儀測定。3h半衰期長,標記時需在特殊裝置中進行,故多由放射性化學試劑中心做成藥盒**。其次b射線的檢測需要昂貴的液體閃爍記數器測定,不易普及,故近來採用化學方法將被檢測物和酪氨酸甲酯生成帶有苯酚基的衍生物,便可用121或125標記。
125半衰期為60d,121半衰期為8d,現今多趨向使用125。
1.2標記方法
放射物標記中最常用的是外標記。碘標記的方法很多,最常用氯胺t法,氯胺t是一種氧化劑,它能使125液中帶負電荷的碘離子氧化成帶正電荷的碘,然後取代抗原酪氨酸殘基芳香環上的氫如圖1。
目前,應用到食品安全此外,氯胺t還可用於純化乳過氧化酶(lactoperoxidase)作催化劑以碘化蛋白質,這是一種最溫和的碘化法,其原理是將酶與過氧化氫形成絡
合物,然後使碘氧化。
1.3 應用現狀
放射性標記法利用同位素標記的高靈敏性和抗原抗體反應的高特異性相結合,精確敏感性好(ng、pg),樣品用量少,易規範化,是其他任何生物測定法所無法比擬的[4]。而且最近有人研究放射性標記在兩相溶液中的檢測,克服了溶劑互不相溶影響抗原抗體特異性反應的靈敏度[5]。然而,其在應用上的缺點也是顯而易見的,如需特殊裝置,雖涉及放射性微小,但仍會面臨公眾反核的負面影響。
此外,放射免疫分析較難進行自動化分析,試劑盒的有效期短的缺點使其面臨新一代更靈敏、穩定、快速而且自動化程度高的測量技術的挑戰[6]。
2 螢光標記分析
以螢光標記的螢光免疫分析(fluorescein immunoassay, fia)是由conn等首創於20世紀40年代的一種標記免疫學技術,其所用標記物是螢光素和螢光染料,是將抗原或抗體標記以螢光物質與相應抗原或抗體結合,在螢光顯微鏡或紫外線照射下,檢測螢光強度和螢光現象的一種檢測方法。螢光標記免疫法靈敏度高,但螢光素常會產生生物學毒性,導致抗體或抗原的靈敏度和選擇性下降[7]。
2.1 標記物（螢光素）
螢光素是將已知的抗體或抗原分子標記上螢光素，當與其相對應的抗原或抗體起反應時，在形成的複合物上就帶有一定量的螢光素，在螢光顯微鏡下就可以看見發出螢光的抗原抗體結合部位，檢測出抗原或抗體。目前常用於標記抗體的螢光素有以下幾種：異硫氰酸螢光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明等，然而,實際應用最廣的只有異硫氰酸螢光素[8]。
這種標記免疫分析法主要是利用了免疫學反應的特異性和螢光素易被發現的敏感性的優點。但由於高本底影響和監測儀器的靈敏度低,螢光標記的技術一直受到限制。
2.2酶作用後產生螢光的物質
某些化合物本身無螢光效應，一旦經酶作用便形成具有強螢光的物質。例如，4-甲基傘酮-β-d半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，後者可發出螢光，激發光波長為360nm，發射光波長為450nm。其他如鹼性磷酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。
5．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪 (eu3+)、鋱 (tb3+) 等的螯合物可發射特徵性的螢光，而且激發光波長範圍寬、發射光波長範圍窄、螢光衰變時間長，最適合於時間分辨螢光免疫測定。
2.3 螢光素標記
螢光素與蛋白質結合的化學反應基團主要有三種型別,即:醯基氯,由磺酸製備;異硫氰酸和重氮鹽類,這兩種通常由相應的胺製備,通過化學鍵作用於相應的抗原、抗體反應結合。目前標記方法主要是透析法和直接標記法兩種。
以fitc標記為例: fitc含有異硫氰基,在鹼性條件下能與igg的自由氨基結合,形成螢光抗體結合物,如圖2。
直接法該法以0．5mol／lph9．5碳酸鹽緩衝液稀釋igg質量分數至2％，取相當於抗體蛋白量1／loo～1／150的fitc溶於相當於igg溶液量1／10的ph9．5碳酸鹽緩衝液中。將fitc溶液在磁力攪拌下，緩慢加入抗體溶液。不同溫度條件下，反應時間有所不同，一般為2～4。
c，6h；7～9℃，4h}20～25℃，l～2h。
透析法有袋內標記和袋外標記兩種。袋內標記是將抗體蛋白以0．025mol／lph9．0的碳酸鹽緩衝液調整其蛋白質量分數至1％，裝透析袋內。稱取蛋白量1／20的fitc溶於10倍抗體溶液量的0．025ml／l碳酸鹽緩衝液中，將裝好的透析袋浸沒於fitc溶液中，置4'c16～18h，其問定期以磁力攪拌器攪拌，每次l～2h。
將透析袋取出，置0．01mol／lph7．1的pbs中透析4h，留待過濾。
2.4 應用現狀
免疫螢光抗體技術的應用(一)細菌學診斷利用免疫螢光抗體技術可直接檢出或鑑定新分離的細菌，具有較高的敏感性和特異性。鏈球菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌屬、宋內氏痢疾桿菌、李氏桿菌、巴氏桿菌、布氏桿菌、炭疽桿菌、馬鼻疽桿菌、豬丹毒桿菌和鉤端螺旋體等均可採用免疫螢光抗體染色進行檢測和鑑定。動物的糞便、黏膜拭子塗片、病變組織的觸片或切片以及尿沉渣等均可作為檢測樣本，經直接法檢出目的茵，具有很高的診斷價值。
對含菌量少的標本，可採用濾膜集菌法，然後直接在濾膜上進行免疫螢光染色，這一方法已在水的衛生細菌學調查、海水細菌動力學研究中得到應用。(-二)病毒病診斷用免疫螢光抗體技術直接檢出患畜病變組織中的病毒，已成為病毒感染快速診斷的重要手段。如豬瘟、雞新城疫等可取感染組織做成冰凍切片或觸片，用直接或間接免疫螢光染色可檢出病毒抗原，一般可在2h內做出診斷報告。
豬流行性腹瀉在臨床上與豬傳染性胃腸炎十分相似，將患病小豬小腸冰凍切片用豬流行性腹瀉病毒的特異性螢光抗體作直接免疫螢光檢查，即可對豬流行性腹瀉進行確診
3 酶標記分析
免疫酶標記技術是繼免疫螢光抗體技術和放射免疫分析之後發展起來的一大新型的血清學技術。2023年，nakane等和**rameas等分別報道用酶代替螢光素標記抗體，建立了酶標抗體技術(enzyme-labelled antibody technique)，用於生物組織中抗原的定位和鑑定。2023年，en**all，van weemen等報道了酶聯免疫吸附試驗，從而建立了酶標抗體的定量檢測技術。
20世紀80年代，基於酶標記抗體檢測和鑑定蛋白質分子的免疫轉印技術問世。目前，免疫酶標記技術已成為免疫診斷、檢測和分子生物學研究中應用最廣泛的免疫學方法之一。
3.1 標記物
用於標記的酶用於標記的酶應具有如下一些特點：①高度的特異活性和敏感性；②在室溫下穩定；③易於獲得並能商品化生產；④與底物反應的產物易於顯現。
到目前為止,酶標記法所用的酶大多是辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。每種酶通過與自己的特殊作用底物反應,而產生典型的有色沉澱物。通過反應的顏色與被檢測物的相關關係,從而對被檢物進行定量分析。
(一)辣根過氧化物酶過氧化物酶廣泛分布於植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)。hrp是由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種醣蛋白(含糖18％)，分子質量約為40ku。hrp的作用底物為過氧化氫，催化時需要供氫體，使產生一定顏色的產物。
二)鹼性磷酸酶鹼性磷酸酶(alkalinephosphatase，akp)，系從小牛腸黏膜和大腸桿菌中提取。akp的底物種類很多，常用對硝基苯磷酸鹽，酶解產物呈黃色，可溶性，最大吸收波長400nm
（三）葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶系從麴黴中提取，對底物葡糖糖的作用長藉過氧化物及其顯色底物來加以顯示。如果顯色底物為鄰苯二胺，則反應後呈棕色，陰性者為黃色，極易用目視法判斷，其靈敏度高於過氧化物標記抗體。
3.2 標記方法
目前標記的技術一般是通過交聯劑將酶與抗體或抗原相結合。交聯方法主要有:戊二醛法、酶醛化法、重氮化法、碳二亞胺法、混合酸酐法、二硝基苯酚法(fnps)、二異氰酸甲苯法(tdi)。
一般都是利用小分子上的活性部位與蛋白質上的氨基、羧基、酚基、巰基或羥基進行化學反應。
3.3 應用現狀
酶標記因其催化底物可與核素一樣起到資訊放大作用,而減少放射性廢物,曾被認為可以完全取代ria。目前,在我國酶標免疫檢測由於其檢測靈敏度高、方法簡單、所用儀器相對便宜,因此發展空間也很大。開發商品試劑盒也有很好得實用價值。
但是,這種依靠比色法的檢測所受的干擾因素太多,其靈敏度和穩定性未能高於ria,而且底物一旦顯色後就難於復原,因此是一次性的。另外,酶結合反應時
間很難確定,酶隨著時間的延長很容易失活,影響測定效果,結果也不容易儲存。有研究者[8]認為,把幾種結構相關或非相關的農藥抗體結合,利用這種混合技術進行幾種農藥的多殘留分析,對於檢測大批量且農藥汙染又沒有規律的樣品,可以節省大量的時間和工作量。
4 發光標記分析
20世紀80年代末,國外開始用化學發光試劑來標記抗原或抗體,從而建立了發光免疫分析技術。狹義的發光免疫分析( luminescence immunoassay,lia )主要是指化學發光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, clia)。另外,還有酶放大化學發光免疫分析和電化學發光免疫分析( electrochemiluminescence immunoassay , eclia)。
clia是sohrocler和halman在20世紀70年代末期建立的,該方法兼有發光分析的高靈敏度和免疫反應的特異性[9]。其基本原理同酶標記分析法,是用化學發光反應的試劑(可以是發光劑或催化劑等)標記抗原或抗體,標記後的抗原和抗體與待測物經過一系列的免疫反應和理化步驟(如離心分離、洗滌等),最後以測定發光強度形式測定待測物的含量。
常見發光免疫分析技術的比較
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