實驗一澱粉酶生產菌的篩選
一、實驗目的
學習澱粉酶產生菌的篩選方法。
二、實驗原理
澱粉酶在釀造、紡織、食品加工、醫藥等領域有廣泛用途。澱粉酶是一類澱粉水解酶的統稱，它能將澱粉水解成糊精等小分子物質並進一步水解成麥芽糖或葡萄糖，澱粉被水解後，遇碘不再變藍色，因此可根據澱粉培養基上透明圈的大小來判斷所選菌株的澱粉酶活力。
三、實驗用品
1．樣品
澱粉含量豐富的土樣。
2．培養基
肉湯培養基：牛肉膏3g，蛋白腖10g，nacl 5g，加水至1000ml，ph7.0。121℃滅菌20min。
初篩平板培養基：牛肉膏3g，蛋白腖10g，nacl 5g，可溶性澱粉 2g，瓊脂 18g，加水至1000ml，ph7.4。121℃滅菌20min。
lugol碘液：碘 1g，碘化鉀 2g，蒸餾水 300ml。先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘溶解於碘化鉀溶液中，待碘全溶後，加足水即可。
3．器材
高壓蒸汽滅菌鍋，超淨工作台，電子天平，電爐，恆溫振盪器，恆溫培養箱；燒杯，量筒，三角瓶，培養皿，移液管，洗耳球，試管，試管架，接種針，塗佈棒。
四、實驗方法
1．培養基製備：
配製肉湯培養基45ml，分裝於250ml三角瓶中，紗布封口，滅菌。配製初篩平板培養基350ml，分裝於500ml三角瓶中，封口膜封口，滅菌。
2．倒平板：
將融化的初篩平板培養基冷卻至50～60℃，以無菌操作法倒至已滅菌的培養皿中，至蓋滿底部。冷卻凝固待用。
3．樣品預處理：
取5g土樣接入45ml肉湯培養基中，30℃搖床振盪15min製成土壤懸液，此時的稀釋度為10-1。另取4支試管，分別記作10-2、10-3、10-4、10-5共5個梯度，每支試管內加入9ml無菌水。用無菌移液管從三角瓶中吸取1ml土壤懸液，加入到10-2試管中混勻，再從此試管中吸取1ml加入到10-3試管中，依此類推直至10-5試管。
4．平板塗佈分離：
分別從不同稀釋度的試管中吸取0.1ml懸液，均勻塗佈於初篩培養基平板上，於30℃培養24～48h。
5．菌株檢測：
待初篩平板長出菌落後，根據菌落不同挑取菌落進行儲存並編號。同時，將檢測試劑（lugol碘液）加入到平板中，塗佈均勻，菌落周圍形成水解圈的菌株即是產澱粉酶的菌株，記住其編號，以便進行下一步實驗。
6．儲存菌種：
將得到的菌株轉接至斜面培養基上，30℃培養48～72h，待菌苔長好後，4℃儲存。
五、思考題
微生物菌種的分離篩選通常包括哪幾個部分？
實驗二澱粉酶酶活測定
一、實驗目的
1．掌握分光光度法測定液化型澱粉酶活力的基本原理和方法
2．從初篩所獲得的菌株中篩選出澱粉酶活力高的菌株
二、實驗原理
澱粉酶是指能催化分解澱粉分子中糖苷鍵的一類酶，包括α-澱粉酶、澱粉1，4-麥芽糖苷酶（β-澱粉酶）、澱粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和澱粉1，6-葡萄糖苷酶（異澱粉酶）。α-澱粉酶可以從澱粉分子內部切斷澱粉的α-1，4糖苷鍵，形成麥芽糖、含6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，使澱粉的粘度下降，因此又稱為液化型澱粉酶。
澱粉遇碘呈藍色。這種澱粉-碘複合物在660nm處有較大的吸收峰，可以用分光光度計測定。隨著酶的不斷作用，澱粉長鏈被切斷，生成小分子糊精，使其對碘的藍色反應逐漸消失，因此可以根據一定時間內藍色消失的程度為指標來測定α-澱粉酶的活力。
三、實驗用品
1．粗酶液
實驗一儲存的菌種進行搖瓶發酵，發酵液離心後可作為粗酶液。
2．試劑
碘原液：稱取碘化鉀22g，加少量蒸餾水溶解，加入碘11g，溶解後定容至500ml，貯於棕色瓶中；
比色用稀釋碘液：取碘原液2ml，加碘化鉀20g，用蒸餾水定容至500ml，貯於棕色瓶中；
2%可溶性澱粉：稱取可溶性澱粉（乾燥至恒重）2g，用少量蒸餾水混合調勻，徐徐傾入煮沸的蒸餾水中，邊加邊攪拌，煮沸2min後冷卻，加水定容至100ml，需當天配製；
ph6.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩衝液：稱取磷酸氫二鈉（na2hpo4·12h2o）4.523g，檸檬酸0.807g，用水溶解並定容至100ml；
0.5mol/l乙酸溶液。
3．器材
離心機，分光光度計，恆溫水浴鍋，試管架，秒錶；試管，移液管，燒杯，離心管。
四、實驗方法
1．標準曲線的繪製：
表2－1標準曲線的製作
將可溶性澱粉稀釋成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀釋液；
吸取澱粉稀釋液2.0ml加至試管中，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液1.0ml，40℃水浴保溫15min；
加蒸餾水1ml，40℃保溫30min後加入0.5mol/l乙酸10ml；
吸取反應液1ml，加入稀碘液10ml，混勻，在660nm下測吸光值a；
以澱粉濃度為橫座標，吸光度為縱座標，作標準曲線。
2．酶液的製備
將發酵液離心（5000r/min，10min），取上清液作為粗酶液，以ph6.0緩衝液稀釋至適當濃度，作為待測酶液。
3．澱粉酶活力測定
按下列程式操作：
五、注意事項
1．澱粉一定要用少量冷水調勻，再倒入熱水中溶解，若直接加到熱水中，會溶解不均勻，甚至結塊。澱粉液應當天配製，配好的澱粉液應是透明澄清的，不能有顆粒狀物質存在。
2．酶液應該進行適當稀釋。
六、作業
1．繪製標準曲線。
2．記錄各樣品的a660，並計算其酶活力，計算方法參見附錄。
七、思考題
1．測定酶活力時，在具體操作上應注意哪些問題？
2．為什麼測定酶活力的試劑要在40℃水浴鍋中預熱？
附：酶活力單位的定義：1ml酶液在40℃、ph 6.0的條件下，每小時分解的澱粉的毫克數。表示為u/ml。
實驗三澱粉酶生產菌發酵條件的優化
一、實驗目的
掌握發酵培養基的配製原則，熟悉用正交試驗優化發酵培養基的方法。
二、實驗原理
發酵條件對產物的形成有著非常重要的影響，其中培養基ph、培養溫度和通氣狀況是三類最主要的發酵條件。培養基ph一般指滅菌前的ph，可以酸鹼溶液調節控制，因發酵過程中ph會不斷改變，所以最好用緩衝溶液來調節；通氣狀況可用培養基裝量和搖床轉速來衡量，封口紗布的厚度也會影響氧氣的傳遞，一般以6～8層為好。
發酵培養基是指大生產時所用的培養基，一般碳源含量較高。工業發酵培養基與菌種篩選時所用培養基不同，以經濟節約為主，一般選用廉價的農副產品為原料。由於天然原料的組分複雜，不同批次的原料成分各不相同，因此發酵前必須進行培養基的優化試驗。
本實驗將對菌株的培養基配方進行優化。
三、實驗用品
1．菌種:實驗一篩選得到的澱粉酶生產菌。
2．器材:搖床，高壓滅菌鍋；三角瓶，燒杯，移液管，試管。
四、實驗方法
1．培養基製備：
以黃豆粉、玉公尺粉、可溶性澱粉、酵母膏作為培養基的主要影響因素，每一因素設定3個水平，按表3-1配製培養基（w/v），另加入na2hpo4 0.8%，(nh4)2so4 0.4%，nh4cl 0.
15%，分裝於250ml三角瓶，每瓶50ml，6層紗布封口，滅菌。取5ml蒸餾水加入試管中，滅菌。
2．接種：
挑取斜面菌苔5環接入5ml無菌水中，搖勻後用無菌移液管吸取0.5ml菌懸液，接到每一組培養基中。30℃，150r/min搖床培養36h左右。
3．結果測定：
參照實驗三方法測定菌株在各培養基中培養的澱粉酶活力。
表3-1 發酵培養基優化正交試驗表
五、作業
將酶活力測定結果填入表3-1，通過正交分析，確定三個因素對酶活力影響的主次順序，並確定最適培養基配方。
六、思考題
正交試驗原理。
實驗四澱粉酶的提取
一、實驗目的
掌握鹽析法的基本原理，學會用鹽析法提取蛋白質。
二、實驗原理
鹽析法是加入中性鹽到蛋白質溶液中，蛋白質的溶解度開始增大，但隨著繼續加入鹽，蛋白質的溶解度卻逐步減小，並形成沉澱，不同蛋白質在不同中性鹽濃度下析出，利用此原理，可對溶液中的雜蛋白質及目的蛋白進行分級沉澱以達到提取分離的目的。
三、實驗用品
1．粗酶液
實驗一儲存的菌種進行搖瓶發酵，發酵液離心後可作為粗酶液。
2．器材
燒杯，布氏漏斗，真空幫浦。
四、實驗方法
1．鹽析：
取120ml發酵液倒入燒杯中，調ph至6.7-7.8，加硫酸銨使其濃度達到40%-42%，加完後靜止數小時（3小時以上），即可抽濾或離心，收集濾餅。
2．加入硫酸銨量的計算方法：
硫酸銨的溶解度在0-30℃變化很少，在水中飽和溶液濃度密度約為1.235g/ml。在20℃飽和溶液為533g/l，但加入硫酸銨體積會變大，1l水中加硫酸銨至飽和需加硫酸銨761g。
考慮到溶液硫酸銨體積要增大，則於20℃時使1lm1摩爾濃度硫酸銨溶液增至m2摩爾濃度，所需的硫酸銨量為g
g=533（m2-m1）/(4.05-0.3m2)
上式如以飽和度表示，則以s1%增至s2%，需加入量為
g=533（s2-s1）/(100-0.3s2)
發酵工程實驗實驗指導書
2014版 寧波大學海洋學院 2014.09 目錄實驗一乳酸菌的分離與初步篩選實驗 實驗二乳酸菌的初步鑑定實驗 實驗三乳酸菌菌種保藏實驗 實驗四乳酸菌的培養與發酵實驗 實驗五乳酸菌發酵產物的分析與測定 實驗六發酵罐操作訓練 實驗一乳酸菌的分離與初步篩選實驗 一 實驗目的及要求 1 掌握從環境樣品中分...
食品發酵工程實驗指導書
實驗一甜酒釀的製作 一 實驗目的 1.通過甜酒釀的製作了解釀酒的基本原理。2.掌握甜酒釀的製作技術。二 實驗要求 三 實驗原理 以糯公尺 或大公尺 經甜酒藥發酵製成的甜酒釀，是我國的傳統發酵食品。我國釀酒工業中的小麴酒和黃酒生產中的淋飯酒在某種程度上就是由甜酒釀發展而來的。甜酒釀是將糯公尺經過蒸煮糊...
發酵實驗方案
芽孢儲存實驗方案 1 實驗目的 防止細菌 芽孢自溶的重要方法是調節溶液ph值。實驗在不同ph值 不同持續時間下細菌芽孢存活情況，從而找出適合細菌芽孢儲存的ph值條件及芽孢產品保質期。2 實驗內容及方法 將已發酵好的芽孢溶液取適量樣品，使用ph調節劑 鹽酸 硫酸 氫氧化鈉 氨水等 進行ph調節，樣品溶...